癲狂夢醒湯對兔動脈粥樣硬化血管基質(zhì)金屬蛋白酶－9表達(dá)的影響

韓鳳麗，于銘權(quán)

基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）能夠分解血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）基膜基質(zhì)，將SMC 從基膜中釋放出來，從而引起VSMC 的移行，在動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用［1］。對AS 來說，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及血脂代謝異常是其發(fā)生的重要始動因素。本實驗通過喂飼高脂飼料的方法，建立兔AS模型，應(yīng)用癲狂夢醒湯進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對動脈內(nèi)膜厚度、MMP－9表達(dá)的影響，以期為癲狂夢醒湯抗AS提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料 健康日本大耳白兔32只，均為雄性，體重（2～2.5）kg（遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）。高脂飼料：1%膽固醇，8%熟豬油和91%的普通飼料。

1.2 藥物、試劑、儀器 癲狂夢醒湯方劑由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬一院中藥局提供。兔抗人MMP－9多克隆抗體（上海太陽生物有限公司），膽固醇粉（安徽科寶生物工程有限公司）。CIAS－1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（北京大恒圖像視覺有限公司）、LEICA－RM－2135石蠟切片機(jī)（德國）。

1.3 方法

1.3.1 藥物（癲狂夢醒湯方）制作 原方藥物：桃仁24g，柴胡9g，香附6g，木通9g，赤芍9g，半夏6g，腹皮9g，青皮6g，陳皮9g，桑皮9g，蘇子12g，甘草15g。在藥學(xué)實驗室浸泡、煎煮、去渣，每付中藥濃縮至100mL，濃度為1.2g／mL（含生藥量）。根據(jù)人體－家兔體表面積比值法換算家兔的每日用藥量［2］：低劑量組3.1mL／（kg·d）相當(dāng)于含生藥量3.8g／（kg·d），高 劑量組4.7mL／（kg·d）相當(dāng)于含生藥量5.7 g／（kg·d）。中藥高劑量為臨床上每日1劑中藥為標(biāo)準(zhǔn)，中藥低劑量為臨床上每1.5 日一劑中藥為標(biāo)準(zhǔn)。4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分組

1.3.2.1 試驗分組 日本大耳白兔單籠飼養(yǎng)，室溫20℃～22℃，相對濕度為50%～60%，自由飲食水。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗：遵循隨機(jī)原則，將動物分成4組（A 空白對照組、B 模型組、C 癲狂夢醒湯低劑量組、D 癲狂夢醒湯高劑量組），每組8只。

1.3.2.2 模型制作［3］實驗開始后，空白對照組繼續(xù)喂飼普通飼料140（g·d）只＋蒸餾水5 ml／kg灌胃；模型組開始喂飼高脂飼料140g／d＋蒸餾水5 ml／kg灌胃；低劑量癲狂夢醒湯組喂飼高脂飼料140g／d＋癲方3.1mL／（kg·d）＋蒸餾水1.9mL／kg灌胃；高劑量癲狂夢醒湯組喂飼高脂飼料140g／d＋癲方4.7mL／（kg·d）＋蒸餾水0.3 mL／kg灌胃；自由飲水，喂養(yǎng)至第12周末。

1.3.3 標(biāo)本留取 實驗動物于第12周末采用頸動脈割傷法處死。迅速剖開腹腔，分離腹主動脈，剝除外膜結(jié)締組織及脂肪，取1cm 動脈血管，沖凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色及免疫組化檢測。

1.3.4 病理形態(tài)學(xué) 將兔主動脈標(biāo)本于4%中性甲醛溶液固定24h之后，自來水沖洗4h～6h，逐級脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片厚度5μm，于45℃溫水中展片，分別用普通玻片和多聚賴氨酸防脫玻片，撈片后置于56℃溫箱中干燥2h～3h，用于HE 染色及免疫組化染色。每一標(biāo)本取3張切片（普通玻片）作HE 染色；每一標(biāo)本取3張切片（防脫玻片）作免疫組化染色，均按試劑盒步驟進(jìn)行操作，免疫組化以細(xì)胞漿染色為主，測定其平均灰度值。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，4組間比較采用單因素方差分析（ANVOA），組間兩兩比較用LSD（方差齊）或DunnettT3（方差不齊）法進(jìn)行顯著性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組內(nèi)膜厚度測定 光鏡下測定，正常組內(nèi)膜厚度5.03μm±0.80μm，模型組269.07μm±37.42 μm，中藥低劑量組72.10μm±6.39μm，中藥高劑量組43.50μm±5.39μm。癲狂夢醒湯組內(nèi)膜厚度明顯低于模型組（P＜0.01）；高劑量癲狂夢醒湯組內(nèi)膜厚度低于低劑量癲狂夢醒湯組（P＜0.05）。

2.2 對MMP－9蛋白表達(dá)的影響 免疫組化示：棕色反應(yīng)物位于胞漿。正常對照組血管壁表達(dá)的少；模型組表達(dá)明顯增多，內(nèi)膜靠近中膜處尤甚，呈棕黃色或棕褐色，融合成片，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，癲狂夢醒湯組表達(dá)明顯減輕（P＜0.01）；與低劑量癲狂夢醒湯組比較，高劑量癲狂夢醒湯組表達(dá)降低（P＜0.01）。灰度值；正常組13.32±3.85，模型組74.58±6.78，中藥低劑量組45.74±6.51，中藥高劑量組33.52±3.64。

3 討 論

中醫(yī)并沒有AS一詞，中醫(yī)將AS形成的首要因素高脂血癥等歸屬為痰濁，將血液的高凝狀態(tài)、血管壁受損、脂斑形成等視為血瘀。由于臟腑功能失調(diào)，氣、血、津液運行、代謝障礙，導(dǎo)致痰濁內(nèi)生，無形之痰濁留而不去，致血行不暢，瘀血阻滯，痰瘀交阻，這種病理狀態(tài)持續(xù)發(fā)展下去，痰借血體，血借痰凝，痰瘀互結(jié)，著于血脈，血脈上凝著痰瘀結(jié)塊使脈管本身受損，局部氣血的運行和溫煦受阻，日久膠結(jié)不解，凝之愈堅，這種痰濁瘀血相凝之結(jié)塊即是AS斑塊［4］。近年來在大量的臨床及實驗研究中，眾多醫(yī)家采用活血化痰中藥防治AS，均取得了良好的治療效果，也進(jìn)一步證實了痰瘀互結(jié)是AS的主要病理機(jī)制。痰瘀互結(jié)是AS的基本病機(jī)，那么選用化痰降濁、活血化瘀法則是治療AS的關(guān)鍵之所在［5］。因此，選擇名方癲狂夢醒湯進(jìn)行研究。方中桃仁、赤芍活血化瘀；柴胡、香附、青皮、陳皮、半夏理氣化痰；蘇子、桑皮、腹皮降氣化痰；木通通利血脈；甘草調(diào)和諸藥。諸藥相合共奏豁痰化瘀利竅之功。

MMP 是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，可為SMC從中 膜 遷 移 至 內(nèi) 膜 掃 清 道 路［6］。其 中MMP－9 是MMP家族中的重要成員，主要功能是降解Ⅳ型膠原和彈力纖維，在基質(zhì)降解、VSMC 遷移、AS 形成以及促進(jìn)斑塊破裂上起重要作用［7］。另外有研究表明，MMP－9可通過激活肝素酶參與SMC 從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換的過程［8］。

本實驗觀察到，模型組MMP－9蛋白表達(dá)較正常對照組顯著增高，內(nèi)膜靠近中膜處尤甚，呈棕黃色或棕褐色，融合成片，主動脈內(nèi)膜明顯增厚，提示在AS 中MMP－9蛋白表達(dá)顯著增高；與模型組比較，癲狂夢醒湯可呈劑量依賴性的降低MMP－9表達(dá)水平，減輕動脈內(nèi)膜增厚，提示癲狂夢醒湯可能通過抑制SMC從中膜向內(nèi)膜下遷移，進(jìn)而抑制AS形成。此結(jié)果與以往研究的系統(tǒng)給予MMP－9抑制劑［9］，早期可抑制AS形成的結(jié)果相同。

癲狂夢醒湯能夠通過降低MMP－9的蛋白表達(dá)，減輕主動脈內(nèi)膜增厚，而起到防治AS的作用。表明癲狂夢醒湯抗AS療效可靠，為臨床應(yīng)用癲狂夢醒湯防止AS提供理論依據(jù)。然而AS的病理機(jī)制是多方面的，癲狂夢醒湯是否也可以通過其他途徑和環(huán)節(jié)來達(dá)到防治AS的作用，尚有待于進(jìn)一步研究。

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