利用NOD小鼠構(gòu)建I型糖尿病模型的研究進展

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利用NOD小鼠構(gòu)建I型糖尿病模型的研究進展

萬繼亞，劉巖厚，王軼楠*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春130061)

I型糖尿病(Type I diabetes，TID)是由遺傳因素和環(huán)境因素共同介導(dǎo)產(chǎn)生的自身免疫性疾病，以自體激活的T淋巴細胞對分泌胰島素的胰島β細胞的進行性破壞為特征，最終導(dǎo)致胰島素不足、血糖調(diào)節(jié)異常、持續(xù)高血糖狀態(tài)和相關(guān)并發(fā)癥出現(xiàn)，是一種復(fù)雜的代謝性疾病。流行病學(xué)研究表明，TID占糖尿病患者總數(shù)的10%左右，每年全球增長率約為3%[1,2]。該文主要就應(yīng)用基因調(diào)控NOD小鼠構(gòu)建人TID動物模型，從胰島β細胞保護機制、自身免疫性T細胞活化調(diào)控機制、誘導(dǎo)外周耐受機制、以及利用模擬人TID的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，針對人免疫細胞靶點的治療方案開發(fā)等方面加以綜述。

1利用NOD小鼠構(gòu)建TID模型概況

在構(gòu)建TID動物模型的早期階段，主要是通過非免疫學(xué)機制(如手術(shù)或藥物)導(dǎo)致胰島β細胞損傷，產(chǎn)生胰島素分泌障礙、持續(xù)高血糖狀態(tài)等類似糖尿病的癥狀。常用藥物有四氧嘧啶(Alloxan)和鏈脲佐菌素(Streptozotoein，STZ)，這兩種藥物引起β細胞損傷的機制雖然不同，但主要都是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的氧自由基造成β細胞損傷，動物都有血糖升高，血糖降低，持續(xù)高血糖三個時相的變化，但模型制備的成功與否受很多因素影響，如動物選擇、給藥劑量、給藥途徑等；并且此類模型雖然能夠引起高血糖等癥狀，可用于研究高血糖所引起的并發(fā)癥，但并不能反映TID真正的發(fā)病機制。

1980年Tochino等通過近親交配和選擇繁殖獲得了一種純系的自發(fā)性非肥胖糖尿病(nonobese diabetic，NOD)小鼠,其發(fā)病特征和病理學(xué)變化與人的糖尿病很相似[3]。雌性NOD小鼠在3周齡時開始出現(xiàn)自身免疫性胰島炎，伴有巨噬細胞、DC以及B、T淋巴細胞胰島內(nèi)浸潤，12至16周齡開始因嚴重胰島β細胞破壞而出現(xiàn)糖尿病癥狀，在30周齡時發(fā)病率可達到60%-80%；雄性NOD小鼠在稍晚期發(fā)病，發(fā)病率在20%-30%左右。組織學(xué)研究顯示，糖尿病出現(xiàn)癥狀前，胰島先有大量的淋巴細胞浸潤，開始分布在胰島細胞周圍或部分胰島細胞內(nèi)，以后逐漸蔓延到腺管和血管周圍，胰島β細胞腫脹、排列紊亂、細胞數(shù)目逐漸減少，以至在后期完全消失。免疫組織化學(xué)研究提示胰島浸潤的細胞主要為T淋巴細胞。

NOD小鼠對于糖尿病的基因易感性是由多個基因位點決定的，其中最為重要的是獨特的MHC單倍體H-2g7，由于Ea基因啟動子區(qū)域的缺失，這一單倍體不表達I-E分子，而是表達I-A分子[4]。與人類糖尿病易感基因同樣，NOD小鼠的糖尿病易感基因?qū)儆贛HC的II類分子。進一步研究發(fā)現(xiàn)NOD小鼠的TID也是由T細胞介導(dǎo)的，B細胞在此過程中作為抗原提呈細胞發(fā)揮作用，而不是介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)?；贜OD小鼠糖尿病的自發(fā)性、發(fā)病率的穩(wěn)定性、相似的病理學(xué)改變和遺傳學(xué)基礎(chǔ)，以及相似的免疫學(xué)發(fā)病機制，利用NOD小鼠構(gòu)建TID模型已經(jīng)廣泛深入的用來探討人TID的發(fā)病機制及臨床診療手段的開發(fā)。

2胰島β細胞保護機制的研究

在TID的發(fā)生發(fā)展過程中，胰島β細胞的損傷是由不同的免疫細胞多重浸潤造成的，抗原提呈細胞，如巨噬細胞、DC等分泌炎性介質(zhì)(TNF-α、IFN-γ、IL-1β和活性氧自由基等)誘導(dǎo)胰島炎癥的發(fā)生和胰島β細胞的損傷；進而這些抗原提呈細胞處理自身抗原并提呈給T細胞，誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，通過釋放各種細胞毒性因子，如炎性細胞因子、顆粒酶、穿孔素等選擇性殺傷胰島β細胞；還可以通過Fas途徑直接誘導(dǎo)胰島β細胞的死亡[5,6]。各種基因調(diào)控NOD小鼠已被用來構(gòu)建TID模型研究胰島β細胞損傷的機制及防治策略。

2.1　調(diào)控效應(yīng)T細胞功能保護胰島β細胞的研究

效應(yīng)T細胞介導(dǎo)胰島β細胞的機制主要包括炎性細胞因子的分泌、FasL-Fas信號通路誘導(dǎo)的細胞凋亡、顆粒酶、穿孔素的分泌等[7,8]。有研究發(fā)現(xiàn)lpr突變Fas缺失的NOD小鼠不產(chǎn)生糖尿病癥狀，患病小鼠細胞轉(zhuǎn)輸也不能誘導(dǎo)發(fā)生糖尿病，表明在胰島β細胞損傷中FasL-Fas途徑很重要[9]；因此有研究者構(gòu)建了胰島素啟動子調(diào)控的胰島β細胞過表達FasL的NOD小鼠，發(fā)現(xiàn)這種小鼠出現(xiàn)較重的糖尿病，并對效應(yīng)T細胞敏感性增強，推測在胰島炎過程中產(chǎn)生的細胞因子可能誘導(dǎo)了胰島β細胞表面Fas的表達，與轉(zhuǎn)基因的FasL發(fā)生交聯(lián)，從而導(dǎo)致對胰島β細胞自身的自殺性攻擊效應(yīng)[10]。

T細胞活化需要雙重信號，首先是T細胞受體識別MHC復(fù)合體提呈的特異性抗原肽，其次還需要共刺激分子的參與。正面的共刺激信號促進T細胞增殖和細胞因子的分泌，負面的共刺激信號誘導(dǎo)T細胞發(fā)生耐受[11]。在研究胰島中浸潤的效應(yīng)T細胞功能調(diào)控中，研究者構(gòu)建了胰島β細胞特異性的由胰島素啟動子調(diào)控的過表達各種相關(guān)基因的NOD小鼠，發(fā)現(xiàn)負向調(diào)節(jié)分子PD-L1(Programmed death-1)的過表達會降低糖尿病的嚴重程度，抑制糖尿病的進展[12]。

2.2　調(diào)控細胞因子網(wǎng)絡(luò)保護胰島β細胞的研究

在TID發(fā)生發(fā)展過程中，促炎性細胞因子和Th1細胞分泌的細胞因子與疾病進展密切相關(guān)，而抗炎性細胞因子，如IL-4、IL-10、TGF-β等則有保護作用。研究者構(gòu)建了多種胰島特異性細胞因子轉(zhuǎn)基因NOD小鼠，以期闡明各種細胞因子在胰島微環(huán)境下對于胰島β細胞和浸潤的淋巴細胞的不同作用。研究表明，在胰島素啟動子下游過表達IL-4、TGF-β會抑制NOD小鼠胰島炎和糖尿病的發(fā)生[13]。胰島局部產(chǎn)生的IL-10加速糖尿病的發(fā)生、延長維持時間，而系統(tǒng)性應(yīng)用IL-10則會有效防止糖尿病的發(fā)生，提示除了免疫抑制效應(yīng)外，IL-10可能還有其他生物學(xué)作用，并且這些作用與IL-10分泌的時間、部位、受其影響的細胞類型都密切相關(guān)[14,15]。IL-35是IL-12家族的成員，研究表明IL-35具有抑制效應(yīng)性T細胞的作用，胰島β細胞上IL-35的過表達會減少NOD小鼠胰腺中T細胞的浸潤和局部增殖，防止糖尿病的發(fā)生[16]。

2.3　調(diào)控趨化因子網(wǎng)絡(luò)保護胰島β細胞的研究

在炎癥過程中，趨化因子能夠募集炎性效應(yīng)細胞到達局部并發(fā)揮免疫活性，在TID發(fā)展進程中，樹突細胞、巨噬細胞、炎癥部位的胰島細胞都能夠分泌趨化因子，引起胰島局部淋巴細胞的大量浸潤。研究表明，在胰島局部通過異位表達趨化因子的受體中和趨化因子的作用，可以減輕淋巴細胞的浸潤，防止糖尿病的發(fā)生。胰島中炎性趨化因子的偽受體D6的過表達能夠有效減少效應(yīng)T細胞在胰島部位的集聚，進而抑制T細胞活化造成的損傷[17,18]。

因此，應(yīng)用NOD小鼠構(gòu)建TID模型，通過在胰島細胞特異性表達免疫調(diào)節(jié)分子，將有助于深入闡明在TID的發(fā)生發(fā)展過程中，淋巴細胞募集到胰島局部，發(fā)揮免疫殺傷效應(yīng)的機制，并有助于免疫治療策略的設(shè)計和開發(fā)。

3TID自身免疫機制的研究

NOD小鼠的糖尿病易感基因?qū)儆贛HC的II類分子，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，自體活化的CD4T細胞發(fā)揮重要作用。為明確TID發(fā)病的自身免疫機制，由易感基因H-2g7提呈的多種胰島自身抗原反應(yīng)性T細胞被克隆鑒定，并建立了相應(yīng)的T細胞受體庫，進而構(gòu)建多種T細胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠。應(yīng)用自體反應(yīng)性CD4T細胞克隆BDC2.5構(gòu)建的T細胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠在三周內(nèi)即可發(fā)生胰島炎，要明顯早于野生型的NOD小鼠，但并不顯示出糖尿病的易感性，只有將其構(gòu)建于NOD/SCID品系后，四周齡小鼠就會發(fā)生嚴重的胰島炎和糖尿病[19]。

CD8T細胞缺陷的小鼠不會發(fā)生胰島炎和糖尿病表明CD8T細胞同樣參與胰島β細胞損傷。為明確TID自身免疫機制中CD4T細胞與CD8T細胞的相互作用，胰島特異性CD8T細胞克隆NY8.3被用來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因NOD小鼠，這種小鼠與非轉(zhuǎn)基因NOD小鼠相比較早發(fā)生糖尿病的癥狀，將NY8.3轉(zhuǎn)基因構(gòu)建到RAG2缺陷，沒有CD4T細胞的NOD背景小鼠之后，糖尿病的發(fā)病率明顯降低，發(fā)病晚于對照組小鼠，表明CD4T細胞在自身免疫性糖尿病發(fā)病中的優(yōu)勢作用[20]。

糖尿病抗原特異性T細胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠除了可以進行自身免疫機制的體內(nèi)研究，也可以分離足夠數(shù)量針對某個特異性抗原的原始T細胞，體外觀察其在不同因素影響下的向Th1、Th2、 Th17、Treg等方向的分化情況，闡明CD4T細胞在糖尿病中的作用機制。然而，基于糖尿病抗原的多樣性，應(yīng)用單一一種抗原特異性CD4T或CD8T細胞受體的轉(zhuǎn)基因小鼠對于體內(nèi)免疫機制的研究也有其過于簡單化的局限性，需要結(jié)合多種因素進行結(jié)果的綜合判斷與分析。

4TID外周免疫耐受機制的研究

TID是由遺傳因素和環(huán)境因素共同影響的自身免疫性疾病，以外周免疫耐受被打破，T淋巴細胞發(fā)生針對自體抗原的免疫反應(yīng)為重要特征，因此TID外周免疫耐受機制的研究對于TID的免疫治療方案的開發(fā)非常重要。體內(nèi)的自體活化T細胞在中樞由胸腺中發(fā)生的負選擇機制誘導(dǎo)凋亡來排除，在外周主要由發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細胞來對抗其作用[21]。

為研究TID外周免疫耐受機制，研究者構(gòu)建了多種胰島特異性表達外來抗原的轉(zhuǎn)基因NOD小鼠，這些小鼠胰島β細胞表面外來抗原的表達(主要是病毒蛋白成分)并不會誘導(dǎo)T細胞介導(dǎo)的對胰島細胞的破壞，然而，當應(yīng)用相關(guān)病毒感染這些小鼠時，外周耐受將會被打破，從而產(chǎn)生針對胰島β細胞的破壞，發(fā)生糖尿病[22]。TID的發(fā)生已經(jīng)被證明與病毒感染密切相關(guān)，如腸病毒、風(fēng)疹病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、細小病毒等。其中在糖尿病患者體內(nèi)，最常見的病毒是屬于腸病毒的柯薩奇病毒，這種病毒會感染多種組織，導(dǎo)致嚴重的胰島炎，并最終通過分子模擬機制或旁觀者效應(yīng)激活T細胞，誘導(dǎo)自身免疫性糖尿病的發(fā)生[23]。這樣，在TID的發(fā)病中，抗原提呈細胞的成熟和活化狀態(tài)也是外周免疫耐受打破的重要環(huán)節(jié)。因此，應(yīng)用NOD小鼠構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，可以深入探討環(huán)境中的病毒感染、基因變異和個體免疫反應(yīng)等多種因素對于TID發(fā)病的共同作用機制。

5人源化MHC轉(zhuǎn)基因小鼠

糖尿病的基因?qū)W研究已鑒定出與糖尿病易感性密切相關(guān)的60個以上的基因位點，超過90%以上的糖尿病患者都擁有獨特的MHC型別。與NOD小鼠的MHC單倍體H-2g7類似，人類的糖尿病易感基因位點為MHC-II類分子HLA-DQ8。以明確的疾病基因易感性為基礎(chǔ)，研究者構(gòu)建了多種人源化MHC轉(zhuǎn)基因小鼠，深入探討了特異性T細胞受體/抗原肽/MHC分子的相互作用在疾病發(fā)展中的影響機制。

DQ8轉(zhuǎn)基因NOD小鼠中CD4+T細胞絕大多數(shù)為DQ8限制性T細胞，可用來鑒定相對應(yīng)的與自身抗原特異性結(jié)合的T細胞表型。除了DQ8基因位點之外，DR4也是重要的糖尿病易感基因位點，并與DQ8呈現(xiàn)明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象。為解析這兩個疾病易感基因位點在TID中的作用，Wen等人構(gòu)建了DR4、DQ8轉(zhuǎn)基因NOD小鼠，發(fā)現(xiàn)DR4轉(zhuǎn)基因小鼠、DR8、DR4共同轉(zhuǎn)基因表達小鼠的TID發(fā)病率顯著低于DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠，顯示DR4分子對于DQ8的糖尿病易感效應(yīng)可能起到負調(diào)節(jié)的作用[24]。這些人源化MHC轉(zhuǎn)基因小鼠能夠促進疾病易感性MHC分子相應(yīng)的自身抗原的鑒定，促進了TID分子機制的闡明和疾病預(yù)防相關(guān)的基因預(yù)測方案的開發(fā)[25]。

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(收稿日期：2014-07-02)

文章編號：1007-4287(2015)07-1234-03

*通訊作者