植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的最佳條件優(yōu)化

■李慧芬 馬 成 張克順

(青島根源生物集團，山東青島266736)

發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量對動物有益的菌種、乳酸、多肽等物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的多功能飼料蛋白。用于發(fā)酵豆粕的菌種多為乳酸菌，在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生大量的乳酸。在豆粕的固態(tài)發(fā)酵中，乳酸菌的主要機制為分泌乳酸和短鏈脂肪酸，可以促進動物對飼料的消化吸收，抑制病原菌的繁殖，刺激有益菌的生長（Marteaup等，2001）。乳酸是一種重要的抗菌化合物，對致病菌的拮抗起著重要的作用，它使腸道內(nèi)的pH值和氧化還原電勢下降，形成腸道內(nèi)酸性環(huán)境，使腸道中不耐酸的致病菌迅速死亡，從而達到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的目的（Serviana等，2004）。在體外，乳酸能抑制腐敗細(xì)菌的生長，從而有效地減少這些微生物產(chǎn)生毒胺、吲哚、氨等致癌物質(zhì)和其他毒性物質(zhì)的可能(Stale等，2005)。乳酸是一種高效、無殘留、無污染的飼料添加劑，具有促進動物生長、延長飼料保質(zhì)期、防止飼料霉變的作用，在飼料中的應(yīng)用越來越廣泛。

乳酸的生產(chǎn)主要有生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法，目前化學(xué)法已逐漸為微生物發(fā)酵法所取代，每年大約有90%的L-乳酸是通過生物發(fā)酵法獲得的(Wang等，2002)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，因菌種和培養(yǎng)液不同，乳酸質(zhì)量和產(chǎn)量有很大差異，乳桿菌以其產(chǎn)酸量高、產(chǎn)酸快、厭氧低能耗、低成本的優(yōu)勢，成為廣大研究者關(guān)注的熱點(Niju等，2004)。近年來，對L-乳酸的生產(chǎn)研究多集中在液體發(fā)酵工藝上，考察乳桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸工藝條件優(yōu)化的報道比較少，本文主要通過單因素與正交試驗結(jié)合，優(yōu)選一株植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：粗蛋白為46%的豆粕，購自龍口香馳糧油有限公司；菌株：植物乳桿菌PHF-3為本實驗室選育保存。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌接種液制備

用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物乳桿菌，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)18 h。

MRS液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.2%、K2HPO4·7H2O 0.2%、吐溫 80 0.1%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025%，pH值6.2。

按國標(biāo)GB 4789.35-2010食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗測定乳酸菌菌量，并用無菌水調(diào)節(jié)乳酸菌濃度為2×108CFU/ml。

1.2.2 固體發(fā)酵基礎(chǔ)條件

豆粕100 g，以2%比例接種植物乳桿菌，加水調(diào)節(jié)料水比為1∶0.4，初始pH值設(shè)定為6，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，發(fā)酵48 h。

1.2.3 L-乳酸測定

10 g發(fā)酵豆粕，加入90 ml水，常溫磁力攪拌1 h，10 000 r/min，離心10 min，取上清，利用SBA-40D生物傳感分析儀，測定L-乳酸含量。

主要測定原理為：生物傳感分析儀內(nèi)含有乳酸氧化酶酶膜，并連接電極。乳酸氧化酶氧化乳酸產(chǎn)生的H2O2的量與被氧化的乳酸量成正比，因此可通過電極測定H2O2的量，來確定乳酸的含量（馮東等，2012）。

1.2.4 單因素試驗

以L-乳酸為指標(biāo)，通過單因素試驗確定外加碳源類別、濃度與發(fā)酵時間等條件對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響。

在固體發(fā)酵基礎(chǔ)條件的前提下，外加1.0%的碳源，共比較5種碳源對L-乳酸產(chǎn)量的影響：紅糖、糖蜜、葡萄糖、玉米淀粉、玉米粉；在前期試驗的基礎(chǔ)上，確定外加碳源的類別，進一步考察外加碳源的濃度對L-乳酸產(chǎn)量的影響：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%；在前期試驗的基礎(chǔ)上，確定外加碳源的類別與濃度，進一步考察發(fā)酵時間對L-乳酸產(chǎn)量的影響，取樣時間點分別為：0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h。每組3個重復(fù)。

1.2.5 正交試驗

綜合3個單因素系列的試驗，基本確定影響植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的各個條件：外加碳源類別、濃度、發(fā)酵時間，并以此為固體發(fā)酵的基本條件，進一步采用L9(34)正交試驗設(shè)計(見表1)，優(yōu)選影響L-乳酸的產(chǎn)生的其他發(fā)酵工藝條件，包括乳酸菌接種量、料水比、發(fā)酵溫度與初始pH值。每組3個重復(fù)。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用正交設(shè)計助手和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，如果方差分析結(jié)果差異顯著，則采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源類別對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響（見圖1）

由圖1可知，5種碳源添加下，植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸存在一定差異。以玉米粉為碳源時，該菌固態(tài)發(fā)酵豆粕僅產(chǎn)L-乳酸14.3 mg/g，低于玉米淀粉或葡萄糖，但未達顯著性差異（P＞0.05）；以糖蜜或紅糖為碳源時，該菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，可產(chǎn)L-乳酸16.8 mg/g或17.0 mg/g，兩者間幾乎無差異（P＞0.05），但與玉米粉之間的差異達顯著水平（P＜0.05）。在實際生產(chǎn)中，外加碳源需考慮性價比，糖蜜的應(yīng)用成本是紅糖的一半左右，且富含生物素、礦物質(zhì)等，是比較合適的工業(yè)乳酸發(fā)酵主料。在后續(xù)的單因素試驗中，其他條件不變，優(yōu)選糖蜜為外加碳源。

圖1 碳源類別對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響

2.1.2 糖蜜濃度對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響（見圖2）

圖2 糖蜜濃度對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響

由圖2可知，在其他發(fā)酵條件一致的情況下，隨著糖蜜濃度的增加，植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸逐漸增加，并在2.0%時達到平衡。當(dāng)糖蜜濃度由0.5%增加至1.0%時，L-乳酸產(chǎn)量呈增加趨勢，但兩者差異未達顯著水平（P＞0.05）；當(dāng)糖蜜濃度繼續(xù)增加至1.5%時，L-乳酸產(chǎn)量繼續(xù)增加，與0.5%間差異顯著（P＜0.05），與1.0%間差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)糖蜜濃度達2%時，植物乳桿菌PHF-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸與低糖蜜濃度0.5%、1.0%等達顯著差異（P＜0.05），與1.5%及其以上濃度，未達顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)糖蜜濃度達到且逐漸大于2.0%時，該乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的含量基本達到平衡，且不再隨著糖蜜濃度的增加而增加。鑒于此結(jié)果，在后續(xù)的單因素試驗中，其他條件不變，外加碳源確定為2.0%的糖蜜。

2.1.3 發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響（見圖3）

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，固態(tài)發(fā)酵豆粕中L-乳酸含量逐漸增加，前32 h時增幅較?。≒＜0.05），之后迅速增加，在64 h時達到平衡（P＜0.05），直至96 h發(fā)酵結(jié)束，L-乳酸含量都沒有再顯著增加（P＞0.05）。由此可見，在外加碳源與濃度確定情況下，植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕能產(chǎn)生的L-乳酸量也是一定的，從產(chǎn)L-乳酸的角度出發(fā)，發(fā)酵時間超過64 h是沒有太大意義的。

綜合3個單因素系列的試驗，基本確定植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸，選用糖蜜為外加碳源，其濃度確定為2.0%，發(fā)酵時間確定為64 h，并以此為固體發(fā)酵的基本條件，進一步采用L9(34)正交試驗設(shè)計(見表1)，優(yōu)選影響L-乳酸的產(chǎn)生的其他發(fā)酵工藝條件，包括乳酸菌接種量、料水比、發(fā)酵溫度與初始pH值。

圖3 發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結(jié)果的直觀與方差分析

按L9(34)正交表，以植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的量為指標(biāo)，進一步優(yōu)化該菌的固態(tài)發(fā)酵工藝。正交試驗安排及結(jié)果直觀分析見表2，方差分析見表3。正交試驗可對各因素的影響進行綜合評價，由極差比較可知，A、B、C、D 4個因素影響植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的主次順序為：B＞C＞D＞A，即：料水比＞發(fā)酵溫度＞初始pH值＞接種量，該結(jié)果與方差分析獲得的影響因素主次順序一致，但未達顯著性差異水平。此外，根據(jù)L9(34)正交試驗分析，植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的最佳條件為A1B3C3D1，即接種量2%，料水比1∶0.6，發(fā)酵溫度42℃，初始pH值6。該優(yōu)化條件并為出現(xiàn)在正交設(shè)計的9個試驗中，需進行最優(yōu)條件的重復(fù)驗證試驗。

表2 產(chǎn)L-乳酸工藝條件的L9(34)正交安排及直觀分析結(jié)果

表3 產(chǎn)L-乳酸工藝條件的正交試驗方差分析

2.2.2 正交最佳條件的驗證

設(shè)計3個平行重復(fù)試驗，對單因素與正交試驗所得的最佳豆粕發(fā)酵條件：以糖蜜為外加碳源，濃度確定為2.0%，發(fā)酵時間64 h，乳酸菌接種量2%，料水比1∶0.6，發(fā)酵溫度42℃，初始pH值6，進行驗證。按正交優(yōu)化條件進行植物乳桿菌的豆粕固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)L-乳酸含量均值為32.1 mg/g，比單因素試驗中最高值20.8 mg/g提高54.33%，同時比正交試驗9個系列試驗中最高L-乳酸含量(30.0 mg/g)提高7%，說明通過正交試驗對豆粕固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，植物乳桿菌PHF-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸含量有較大幅度提高。

平行重復(fù)驗證試驗結(jié)果分別為31.9、32.1和32.3 mg/g，平均值為32.1 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.62%，說明該正交優(yōu)化條件具有良好的重復(fù)性，且在該優(yōu)化條件下，植物乳桿菌PHF-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸具有較好的穩(wěn)定性.

3 討論

L-乳酸的市場流通價格低廉，以高純度糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸顯然是不經(jīng)濟的(Solange等，2008)。糖蜜是制糖業(yè)的主要副產(chǎn)物，因其富含蔗糖，可以被多種L-乳酸生產(chǎn)菌株直接代謝發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。Sule等通過考察米根霉以甜菜糖蜜為碳源發(fā)酵產(chǎn)乳酸的情況發(fā)現(xiàn)，甜菜糖蜜不經(jīng)處理可直接用于L-乳酸發(fā)酵，不需要額外添加其他營養(yǎng)成分(Sule等，2004)。本試驗考察外加碳源對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響，最終選定以糖蜜為外加碳源，這是一種儲存量大的廉價原材料，在提高L-乳酸產(chǎn)量的同時，也極大地節(jié)約了應(yīng)用成本。

乳酸發(fā)酵過程的要點在于營養(yǎng)物質(zhì)的控制，若營養(yǎng)物添加太少，則菌體生長緩慢，pH值變化不活躍，發(fā)酵速度很低，產(chǎn)量低，周期長；相反，若添加過多，則菌體生長旺盛，發(fā)酵加快，由于菌體過多消耗營養(yǎng)物而使發(fā)酵產(chǎn)率降低（王博彥等，2000）。糖蜜濃度對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響試驗結(jié)果也顯示了類似的趨勢，過多的糖蜜添加并未提高L-乳酸的產(chǎn)量，反而造成了浪費，在乳酸菌接種量確定的情況下，2.0%的糖蜜添加，即可滿足該菌對碳源的需求。

仇俊鵬等以7 L小罐液體發(fā)酵為體系，跟蹤了乳酸菌菌量與L-乳酸隨發(fā)酵時間的變化，16 h時菌體量達到最大，60 h左右L-乳酸含量達到最高，說明在L-乳酸的發(fā)酵過程中，生長與產(chǎn)物合成并不同步（仇俊鵬等，2007）。本試驗中，跟蹤了發(fā)酵時間對植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的影響，確定64 h是比較合適的豆粕固態(tài)發(fā)酵周期，此時L-乳酸含量達到平衡。在本次試驗的3個單因素中，發(fā)酵時間對L-乳酸產(chǎn)量的影響最大。

胡瑞等研究了固態(tài)發(fā)酵中各工藝參數(shù)對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，其中針對粗蛋白含量提升指標(biāo)上，1∶0.6的料水比是1∶0.4料水比的1.1倍（胡瑞等，2013），或因較多的水分，更有利于豆粕水解，從而提供更多的氮源，進而促進植物乳桿菌的生長與L-乳酸產(chǎn)量的提升。在本次正交試驗中，料水比是主要影響植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的因素，最佳水平為1∶0.6，與該試驗結(jié)果具有一致性。

丁紹峰等以豆粕水解液為氮源，研究了發(fā)酵溫度、接種量等對L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示：42℃是比較合適的發(fā)酵溫度，接種量也并非越高越好。本次正交試驗中，對30、37℃與42℃三個發(fā)酵溫度進行比較，最終確定42℃下豆粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸含量最高，與前人的試驗結(jié)果較為一致。在發(fā)酵過程中，過高的接種量會導(dǎo)致前期產(chǎn)酸速度過快，營養(yǎng)消耗過多，后期菌體老化產(chǎn)酸速度放慢，從而影響最終L-乳酸產(chǎn)量(丁紹峰等，2006)。此外，在乳酸發(fā)酵中，產(chǎn)物乳酸的反饋抑制，也是限制乳酸發(fā)酵過程的主要因素（錢志良等，2003）。植物乳桿菌的發(fā)酵液含有一定量的乳酸，對該菌在豆粕中的生長繁殖，有一定程度的抑制作用，本次正交試驗結(jié)果也顯示，2%的乳酸菌接種量，是比較優(yōu)化的接種劑量，其發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的效果，略強于4%或6%。

徐國謙等研究發(fā)現(xiàn)，氨水和NaOH均可以很好地將發(fā)酵液的pH值實時控制在6左右，此時菌產(chǎn)乳酸能力最強(徐國謙等，2007)。在固態(tài)發(fā)酵中，很難做到對發(fā)酵體系pH值的實時控制，因此需在發(fā)酵前調(diào)節(jié)初始pH值，本次正交試驗結(jié)果顯示，與7和8相比，6仍是比較合適的固體發(fā)酵初始pH值，或因該pH值條件比較適合植物乳桿菌的生長繁殖。

4 小結(jié)

本研究通過單因素試驗，確定了植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸，可選用糖蜜為外加碳源，其濃度確定為2.0%，發(fā)酵時間確定為64 h，并以此為固體發(fā)酵的基本條件，進一步采用L9(34)正交試驗設(shè)計，優(yōu)選影響L-乳酸含量的其他發(fā)酵工藝條件，最終確定影響植物乳桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸的主次順序為：料水比＞發(fā)酵溫度＞初始pH值＞接種量，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：乳酸菌接種量2%，料水比1∶0.6，發(fā)酵溫度42℃，初始pH值6。對單因素與正交試驗所得的最佳豆粕發(fā)酵條件進行驗證，平均值為32.1 mg/g，比單因素試驗中最高值20.8 mg/g提高54.33%，同時比正交試驗9個系列試驗中最高L-乳酸含量(30.0 mg/g)提高7%，說明通過正交試驗對豆粕固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，植物乳桿菌PHF-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸含量有較大幅度提高。驗證重復(fù)試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.62%，說明該正交優(yōu)化條件具有良好的重復(fù)性，且在該優(yōu)化條件下，植物乳桿菌PHF-3發(fā)酵豆粕產(chǎn)L-乳酸具有較好的穩(wěn)定性。本研究確定了豆粕經(jīng)植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)L-乳酸的最佳條件，顯著提高了L-乳酸的產(chǎn)量，為進一步探討L-乳酸的固態(tài)發(fā)酵工藝奠定了基礎(chǔ)。

（參考文獻14篇，刊略，需者可函索）