Plackett-Burman聯(lián)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵加工紫蘇餅飼料的研究

■ 冷進(jìn)松 朱 珠 周躍勇

(1.吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長春130062；2.糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130062；3.秦皇島正大有限公司，河北秦皇島066200)

紫蘇籽蛋白質(zhì)含量為20%～23%，紫蘇餅是紫蘇籽物理壓榨提油后的副產(chǎn)品，氣味芳香，適口性好，適合在飼料中使用。120℃壓榨法脫脂后紫蘇餅中粗蛋白含量(N×6.25，干基)可達(dá)31.22%[1-2]，其中氨基酸種類達(dá)18種，含有動(dòng)物所必需的8種氨基酸，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源。但是，國內(nèi)企業(yè)主要通過熱榨和有機(jī)溶劑浸提法提取紫蘇油，提油后的紫蘇餅中蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，營養(yǎng)價(jià)值較低。因此，為了充分發(fā)揮紫蘇餅的飼用價(jià)值，只有進(jìn)一步處理以提高其在動(dòng)物體內(nèi)的消化吸收，才能更好利用這一蛋白質(zhì)資源[3]。

將紫蘇餅通過生物發(fā)酵處理后，使其中的各種抗原成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子等被有效降低去除，紫蘇餅中蛋白質(zhì)被分解成植物小肽，這種小肽吸收率高，可作為斷奶仔豬、幼禽，尤其是許多高檔經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的優(yōu)良蛋白質(zhì)來源?，F(xiàn)代生物代謝研究表明，動(dòng)物攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用后，大部分是以小肽形式吸收，小部分才以游離氨基酸的形式被吸收。其中以肽形式的吸收占蛋白質(zhì)總量的70%以上，分子量小于1 000的小分子肽吸收率在90%以上。因此，肽可以作為腸道營養(yǎng)劑或流態(tài)食品，快速補(bǔ)充營養(yǎng)，用于維持和改善蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀態(tài)[4-6]。由于幼畜的消化酶系統(tǒng)發(fā)育不完全，對于植物蛋白質(zhì)的消化能力較弱，幼畜食用肽后發(fā)生過敏反應(yīng)。利用多菌種、多溫相、多重發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)新型發(fā)酵紫蘇餅在飼料中應(yīng)用后，可顯著抑制消化道疾?。煌ㄟ^動(dòng)物機(jī)體免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長[7]。

本研究以120℃壓榨紫蘇餅為主要原料，采用固體發(fā)酵法，旨在提高紫蘇餅中肽的含量，提高其在機(jī)體內(nèi)的消化吸收率，通過多菌種混合發(fā)酵，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期將來能實(shí)現(xiàn)利用紫蘇餅通過發(fā)酵法來生產(chǎn)飼料的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壓榨紫蘇餅：吉林沃達(dá)食品有限公司生產(chǎn)；黑曲霉：鶴壁市百惠生物科技有限公司生產(chǎn)；米曲霉：東興展豐生物制品廠生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

AY120型島津托盤電子分析天平(日本島津制作所)；101A-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；FW-80萬能粉碎機(jī)(上海仕元科學(xué)器材有限公司)；PHS-802酸度計(jì)(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

將紫蘇餅烘干后粉碎至40目，加入5%的麩皮作為膨松劑，50 g紫蘇餅粉末和5%的尿素作為氮源，混勻，加入一定量的純凈水調(diào)制至含水量為65%左右，分裝入250 ml三角瓶，用6層紗布封口，121℃滅菌20 min。將米曲霉和黑曲霉混合菌種（1∶1）以總量為10%的比例接人固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，置于33℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于烘箱中90℃烘干，粉碎至100目后測定紫蘇餅蛋白的水解度。

1.3.2 紫蘇餅蛋白水解度的測定：pH-stat法。

式中：B——堿液體積（ml）；

Nb——堿液的摩爾濃度（mol/l）；

a——氨基的離解常數(shù)；

Mp——底物中蛋白質(zhì)的含量（g）；

Htot——底物中蛋白質(zhì)的肽鏈總數(shù)（mmol/g），本試驗(yàn)取8。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以壓榨紫蘇餅中蛋白的水解度為指標(biāo)，研究混合菌種比例、混合菌種添加量、外加水量、尿素用量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對紫蘇餅中蛋白水解度的影響。采用單次單因素法，假定各因素不存在交互作用，當(dāng)其它因素保持不變，只改變其中一個(gè)因素，然后逐個(gè)進(jìn)行考察分析[8]。

1.3.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對混合菌種比例（w：w）、混合菌種添加量（%）、外加水量(%)、尿素用量（%）、發(fā)酵溫度（℃）、發(fā)酵時(shí)間(d)6個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取低水平“-1”和高水平“l(fā)”。另設(shè)2個(gè)虛擬列，設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)，以水解度Y為回應(yīng)值，Plackett-Burman試驗(yàn)因素及結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 混合菌種比例對紫蘇蛋白水解度的影響(見圖1)試驗(yàn)以米曲霉和黑曲霉的不同混合比例為發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，分別采用米曲霉菌∶黑曲霉為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3五個(gè)不同的接菌比例進(jìn)行發(fā)酵，其中培養(yǎng)基含水量為50%，發(fā)酵條件為36℃、發(fā)酵時(shí)間為3 d。由圖1可以看出，蛋白水解度隨混合菌種比例變化呈先上升后下降的趨勢，菌種比例不同發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白水解度有一定的差異，當(dāng)菌種比為2∶1時(shí)達(dá)到最高，為35.76%，且發(fā)酵后，產(chǎn)物略有結(jié)塊現(xiàn)象，有曲香產(chǎn)生，發(fā)酵產(chǎn)物局部表面有一層白色菌體。由于米曲霉和黑曲霉繁殖速度的差異，改變接種比例后，分泌出的蛋白酶量也相應(yīng)降低，最終影響了蛋白水解度下降。

圖1 混合菌種比例對紫蘇蛋白水解度的影響

2.1.2 混合菌種添加量對紫蘇蛋白水解度的影響（見圖2）

圖2 混合菌種添加量對紫蘇蛋白水解度的影響

由圖2可見，隨著接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白水解度逐漸提高，當(dāng)接種量為10%左右時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白水解度最高，當(dāng)繼續(xù)增加接種量時(shí)，蛋白水解度反而下降，這主要是由于接種量過大，雖使發(fā)酵周期縮短，菌體生長速度加快，但菌絲易老化，且發(fā)酵中的營養(yǎng)物質(zhì)更多的消耗在菌體生長上，故產(chǎn)品中蛋白水解度先上升后下降趨勢[9]。

2.1.3 外加水量對紫蘇蛋白水解度的影響（見圖3）

圖3 外加水量對紫蘇蛋白水解度的影響

由圖3可見，隨著外加水量的增加，產(chǎn)品蛋白水解度呈先上升后下降趨勢。當(dāng)加水量為45%～55%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白水解度最高。說明此含水量最適宜微生物生長繁殖，同時(shí)也可能是因?yàn)榛|(zhì)的細(xì)小顆粒之間存在合適的疏松度，有利于氧的溶入和CO2的排出，促進(jìn)微生物菌體生長，分泌出更多的蛋白酶，從而使發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白水解度增加。

2.1.4 尿素用量對紫蘇蛋白水解度的影響（見圖4）

圖4 尿素用量對紫蘇蛋白水解度的影響

由圖4可知，紫蘇餅蛋白水解度隨尿素用量增加呈先上升后下降趨勢，其中，當(dāng)尿素用量在1.5%時(shí)，蛋白水解度最高。尿素可為混合菌種的繁殖提供氮源，隨著用量的增加，混合菌種繁殖速度加快，分泌蛋白酶也越多，從而使蛋白水解度上升。但隨著用量增加，超過了混合菌種最適的生長pH值范圍，又會(huì)抑制混合菌種的生長繁殖，使蛋白水解度下降。

2.1.5 發(fā)酵溫度對紫蘇蛋白水解度的影響（見圖5）

圖5 發(fā)酵溫度對紫蘇蛋白水解度的影響

由圖5可見，紫蘇餅蛋白發(fā)酵過程中蛋白水解度隨溫度的升高呈先緩慢上升后急劇下降趨勢。這是由于米曲霉最適溫度為32℃左右，黑曲霉最適溫度為30℃左右，兩菌的最適溫度不是在同一范圍內(nèi)，混菌發(fā)酵的最適溫度不一定是各菌種單獨(dú)生長、發(fā)育的最適溫度，從而在混菌發(fā)酵過程中紫蘇餅蛋白水解度隨溫度的變化不是單一的正態(tài)分布，發(fā)酵溫度在30～34℃之間時(shí)，蛋白水解度較大。

2.1.6 發(fā)酵時(shí)間對紫蘇蛋白水解度的影響（見圖6）

圖6 發(fā)酵時(shí)間對紫蘇蛋白水解度的影響

由圖6可見，在發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)品中蛋白水解度逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為3 d左右時(shí)，產(chǎn)品中蛋白水解度最高。此時(shí)應(yīng)停止發(fā)酵，如繼續(xù)發(fā)酵會(huì)因各類微生物自身生理需要而發(fā)生自溶，從而導(dǎo)致蛋白下降。在工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵周期過長，還可能造成雜菌污染，影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，增加生產(chǎn)成本，故發(fā)酵時(shí)間以2～3 d左右為宜。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

利用Minitab對Plackett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，其預(yù)測誤差平方和為71.88%，回歸方程的系數(shù)R2為96.88%；調(diào)整后R2為91.41%。

表2 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

從檢驗(yàn)結(jié)果可以看出：主效應(yīng)中，混合菌種比例(x1)、混合菌種添加量（x2）、外加水量(x3)、發(fā)酵溫度(x5)、4個(gè)主要因素效應(yīng)顯著，其P值分別為0.006、0.007、0.003和0.012，均小于0.050，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。其他因素對結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，取中間水平，對影響效果不進(jìn)行分析[10]。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 正交試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇紫A-混合菌種比例(w∶w)、B-混合菌種添加量(%)、C-外加水量(%)、D-發(fā)酵溫度(℃)4因素3水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。選用L18(37)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表3可知，各因素對紫蘇餅蛋白水解度影響程度的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即混合菌種添加量為主要影響因素，其次為外加水量，再次為混合菌種比例，發(fā)酵溫度影響最小，最佳方案為A3B3C3D2，即混合菌種比例為1∶1、混合菌種添加量10%、外加水量55%、發(fā)酵溫度36℃。由表4可知，混合菌種添加量、外加水量對紫蘇餅蛋白水解度有顯著影響。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法快速篩選了對紫蘇餅蛋白水解效果有影響的各個(gè)因素，既省時(shí)也可同時(shí)比較分析各因素之間的交互作用，保證了試驗(yàn)的精確性[11]?；旌暇N比例、混合菌種添加量、外加水量、發(fā)酵溫度是紫蘇餅發(fā)酵的主要因素，經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)，測得最優(yōu)工藝條件為：米曲霉與黑曲霉的接種比例為1∶1，接種量為10%，外加水量為55%，發(fā)酵溫度為36℃?；旌暇N發(fā)酵紫蘇餅可明顯提高蛋白水解度，提高了紫蘇餅的利用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值?；炀诎l(fā)酵過程中產(chǎn)生了中性蛋白酶，有利于降解紫蘇餅中的蛋白質(zhì)，使其變成易于消化的肽類及氨基酸。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析

表4 方差分析結(jié)果