復方中草藥飼料添加劑發(fā)酵工藝的研究

■郭 舒 刁新平 宋玉卓 高鵬輝

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱150030）

目前，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗生素濫用現(xiàn)象相當嚴重[1]。雖然抗生素在提高生產(chǎn)效益上發(fā)揮了一定的積極作用，但其所導致的負面效應(yīng)也越來越引起人們的關(guān)注。2006年1月1日，歐盟全面禁止抗生素作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖中的使用。面對世界各國逐步禁用抗生素飼料添加劑的趨勢，我國對綠色飼用抗生素替代品的需求亟待解決[2]。發(fā)酵炮制中草藥有著獨特的優(yōu)勢。本研究選用馬齒莧、黃芪、黨參、麥芽、木香等中草藥按比例制成復方，用單因素和正交試驗相結(jié)合的試驗設(shè)計最終確定其最佳的發(fā)酵工藝，其中，發(fā)酵微生物為枯草芽孢桿菌，以復方中草藥發(fā)酵前后多糖含量變化為檢測指標，為飼用抗生素替代品的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：枯草芽孢桿菌(購于保定瑞谷科技有限公司)。

試驗原料：中草藥（均購自哈爾濱藥材市場）、酵母膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、蒸餾水、濃硫酸、鹽酸、蒽酮及其他試劑均為分析純（購自哈爾濱化學試劑公司）。

儀器：超凈工作臺（DL-CJ-ZND北京東聯(lián)哈爾一起制造公司）。

紫外分光光度計：SHIMADZU UV-2401PC。

電熱恒溫培養(yǎng)箱（?，擥HX-9880B-1）；高壓滅菌鍋（MLS-3020）。

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP系列）：購自武漢海聲達設(shè)備儀器有限公司。

可調(diào)溫水浴鍋（DK-S12）：上海森信實驗儀器有限公司。

超聲波提取機（KQ-500DB）：型數(shù)控超聲波粉碎機，昆山市超聲儀器有限公司。

電子天平（AR1140）：梅特勒-托利儀器上海有限公司。

電熱恒溫震蕩培養(yǎng)箱（THZ-82）：常州國華電器有限公司。

熱空氣消毒箱（GR140）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

將樣品葡萄糖在105℃烘箱中烘至恒重，使用分析天平稱取0.010 g于100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，得到葡萄糖標準溶液。移液槍分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml葡萄糖標準溶液至干凈具塞試管內(nèi)，加蒸餾水至1 ml。各試管加入硫酸蒽銅溶液（0.1 g蒽酮溶于100 ml 80%濃硫酸中）4 ml，沸水中加熱10 min，冷卻至室溫。

分光光度計在625 nm測其吸光度。對所得值進行線性回歸，得到回歸方程：y=83.93x+0.011，R2=0.998。

1.2.2 含糖量的測定

中草藥在烘箱中烘干后，粉碎，過60目篩，按比例配成27.5 g放入250 ml三角瓶中用玻璃棒攪拌均勻，在無菌操作臺中紫外照射30 min。取三角瓶中中草藥粉末0.5 g放入250 ml三角瓶中，加入45 ml 80%乙醇浸泡30 min，超聲30 min，用加有濾紙的漏斗過濾棄去濾液。過濾后中草藥殘渣再次放入250 ml三角瓶中，重復上述操作1次。將濾渣放入烘箱中烘干，加入2%鹽酸，沸水浴1 h，冷卻至室溫后過濾到100 ml容量瓶中，重復操作1次，合并濾液，用2%鹽酸定容。混勻，取1 ml中草藥提取液于25 ml容量瓶中，用2%鹽酸定容，取1 ml于具塞試管中，加入4 ml硫酸蒽酮溶液，沸水浴10 min，涼水冷卻至室溫，分光光度計625 nm下測定吸光度。得到未發(fā)酵復方中草藥含糖量為10.05%。

1.2.3 菌種的活化

取適量菌粉于滅菌生理鹽水中，在無菌操作臺里浸泡24 h后，接種到裝有枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的三角瓶里。放置到電熱恒溫震蕩培養(yǎng)箱，37℃，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)兩代后，對枯草芽孢桿菌進行平板計數(shù)，比較該菌正?；罹鷶?shù)（30億/g），來決定復壯次數(shù)。

1.2.4 復方中草藥的發(fā)酵

5種中草藥進行粉碎后過60目篩。取復方中草藥粉末27.5 g入250 ml三角瓶，在無菌操作臺中紫外滅菌30 min，按比例加入菌液、滅菌蒸餾水，用封口膜封好，在設(shè)定溫度下培養(yǎng)，篩選最適接菌量、料水比、時間、溫度，再進行正交試驗。

1.2.5 料水比對復方中草藥發(fā)酵的影響

每份稱取復方中草藥粉末27.5 g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。料水比分別為1∶0.5，1∶0.6，1∶0.7，1∶0.8，1∶0.9，1∶1，接菌量4%，培養(yǎng)時間72 h，培養(yǎng)溫度37℃，入電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節(jié)方法測發(fā)酵藥物的多糖含量，確定最佳料水比。

1.2.6 接菌量對復方中草藥發(fā)酵的影響

每份稱取復方中草藥粉末27.5 g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。接菌量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，料水比由1.2.5節(jié)確定，培養(yǎng)時間72 h，培養(yǎng)溫度37℃，入電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節(jié)方法測發(fā)酵藥物的多糖含量，確定最佳發(fā)酵接菌量。

1.2.7 培養(yǎng)時間對復方中草藥發(fā)酵的影響

每份稱取復方中草藥粉末27.5 g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。發(fā)酵時間分別為24、48、72、96、120、144 h，料水比由1.2.5節(jié)確定，接菌量由1.2.6節(jié)確定，培養(yǎng)溫度37℃，入電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2方法測發(fā)酵藥物的多糖含量，確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.8 培養(yǎng)溫度對復方中草藥發(fā)酵的影響

每份稱取復方中草藥粉末27.5 g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。培養(yǎng)溫度為分別為29、31、33、35、37、39℃，料水比由1.2.5節(jié)確定，接菌量由1.2.6節(jié)確定，時間由1.2.7節(jié)確定，入電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節(jié)方法測定發(fā)酵藥物的多糖含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.9 正交試驗優(yōu)化復方中草藥的發(fā)酵條件

在單因素試驗條件下確定適合復方中草藥發(fā)酵接菌量、料水比、溫度、時間的最適值，在此基礎(chǔ)上進行四因素三水平的正交試驗，發(fā)酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節(jié)方法測發(fā)酵藥物的多糖含量，確定最佳發(fā)酵方案。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比對復方中草藥發(fā)酵的影響

不同料水比對復方中草藥發(fā)酵的影響如圖1所示。由圖1可知，料水比為1∶0.5，1∶0.6時，藥物發(fā)酵后多糖含量逐漸增加，料水比1∶0.6時多糖含量最高，之后多糖含量隨著水分的增加而減少，料水比為1∶1時，發(fā)酵藥物多糖含量下降幅度較大。單因素條件下1∶0.6為藥物發(fā)酵最佳料水比。

圖1 料水比對復方中草藥發(fā)酵的影響

2.2 接菌量對復方中草藥發(fā)酵的影響

不同接菌量對復方中草藥發(fā)酵的影響如圖2所示。由圖2可知，接菌量為2%、4%、6%時發(fā)酵后藥物多糖含量逐漸升高，接菌量為6%、8%、10%、12%時發(fā)酵后藥物多糖含量逐漸降低。在單因素條件下6%為藥物發(fā)酵最佳接菌量。

圖2 接菌量對復方中草藥發(fā)酵的影響

2.3 時間對復方中草藥發(fā)酵的影響

不同時間對復方中草藥發(fā)酵的影響如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)時間在24～48 h范圍內(nèi)，發(fā)酵藥物多糖含量快速上升，培養(yǎng)時間在48～144 h范圍內(nèi)，發(fā)酵藥物多糖含量逐漸降低。單因素條件下48 h為藥物發(fā)酵最佳時間。

圖3 時間對復方中草藥發(fā)酵的影響

2.4 溫度對復方中草藥發(fā)酵的影響

不同溫度對復方中草藥發(fā)酵的影響見圖4。由圖可知，溫度在29～35℃范圍內(nèi)，發(fā)酵藥物多糖含量逐漸升高，35～39℃范圍內(nèi)藥物多糖含量逐漸下降。單因素條件下，35℃為藥物發(fā)酵最佳溫度。

圖4 溫度對發(fā)酵中草藥的影響

2.5 正交試驗優(yōu)化復方中草藥的發(fā)酵條件

由單因素試驗確定正交試驗各因素的水平值，如表1，正交試驗操作表如表2，方差分析結(jié)果如表3。

表1 4因素3水平正交試驗因素和水平

表2 4因素3水平正交試驗

表3 方差分析

由表2、表3可知，4個因素對發(fā)酵后復方中草藥多糖含量影響的主次順序為：D（溫度）＞C（時間）＞A（料水比）＞B（接菌量），可知發(fā)酵工藝條件最佳組合為A1B1C2D3。方差分析結(jié)果表明D(溫度)、C（時間）對發(fā)酵試驗結(jié)果的影響極顯著(P＜0.01)，A（料水比）對發(fā)酵試驗結(jié)果影響顯著(P＜0.05)，B(接菌量）的影響不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵復方中草藥（馬齒莧、黃芪、黨參、麥芽、木香）的最佳工藝組合為：料水比1∶0.5，接菌量4%，時間48 h，溫度37℃。此條件下發(fā)酵的復方中草藥多糖含量為17.98%。

3 討論

微生物在發(fā)酵中草藥的過程中，產(chǎn)生的酶類可以消化植物細胞壁，釋放活性物質(zhì)[3-4]，降解有毒物質(zhì)，產(chǎn)生新物質(zhì)[5-6]。國家科技部已將中藥發(fā)酵工程列入“十五發(fā)展計劃”[7]，中草藥發(fā)酵技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。

在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)溫度是影響微生物生長的最重要因素之一[8]。參與細胞內(nèi)生化反應(yīng)酶的活性與溫度息息相關(guān)。當培養(yǎng)溫度低于微生物最佳生長溫度時，其生長速率大于死亡速率，降解中草藥基質(zhì)產(chǎn)生較多的多糖，培養(yǎng)溫度高于最佳溫度時，微生物生長速率小于死亡速率，其他適宜雜菌的生長加快，枯草芽孢桿菌不再是優(yōu)勢菌群，雜菌利用了基質(zhì)中的多糖，降低基質(zhì)中多糖含量。固體發(fā)酵時，隨著微生物的生長，會產(chǎn)生大量的熱，引起物料溫度的變化，一般情況下，固態(tài)發(fā)酵物料在一定溫度范圍內(nèi)波動。由于試驗發(fā)酵所用物料很少（27.5 g），培養(yǎng)箱恒溫控制，可忽略發(fā)酵物料溫度的波動。但大規(guī)模發(fā)酵時，由于物料熱傳導性差，固態(tài)基質(zhì)內(nèi)部溫度變化大，直接影響菌群生長，所以要控制好發(fā)酵溫度，具體措施有待研究。

微生物發(fā)酵都有一個最佳時間階段[9]。在發(fā)酵過程中，產(chǎn)物的濃度是變化的，一般產(chǎn)物高峰生產(chǎn)階段時間越長，生產(chǎn)率也越高，但到一定時間產(chǎn)物產(chǎn)量會減緩，甚至下降。所以發(fā)酵時間不是越長越好。

水是細胞生命活動的內(nèi)環(huán)境，物料含水量的變化會影響微生物的生長及代謝[10]?；|(zhì)底物的含水率，必然影響發(fā)酵結(jié)果。微生物在固態(tài)基質(zhì)上的生長取決于水活度(aw），水活度與培養(yǎng)基中水分含量有關(guān)，兩者的關(guān)系與溫度及物料性質(zhì)有關(guān)，不是正比關(guān)系，但具體關(guān)系目前還沒有研究。每種微生物有屬于自己的最適aw。aw值太低，微生物生長緩慢，甚至死亡。隨著含水量的升高，導致基質(zhì)中氧的傳質(zhì)阻力升高，多孔性降低，減少了O2的供給，影響了枯草芽孢桿菌的生長，增加了污染雜菌的危險，以致雜菌消耗基質(zhì)中的多糖，使多糖含量低于未發(fā)酵基質(zhì)。在固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中，水含量應(yīng)控制在既能供微生物大量生長又低于雜菌生長所需要的程度，一般的固態(tài)發(fā)酵濕基含水量在50%左右[11]。

人工接種的微生物具有生長優(yōu)勢，培養(yǎng)基中接入合適的菌量能縮短菌體的停滯期，使菌體生長快速進入生長對數(shù)期，進而縮短發(fā)酵周期；但是不適合的接種量可能使菌體處于停滯期的時間加長，菌體生長緩慢，其他雜菌趁機生長，影響基質(zhì)的正常發(fā)酵。本研究結(jié)果顯示接菌量數(shù)值在一定范圍內(nèi)浮動對發(fā)酵結(jié)果無顯著影響。

我國固態(tài)發(fā)酵技術(shù)歷史悠久，現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵工程在發(fā)酵工藝上進行了多方面的技術(shù)改進。固態(tài)發(fā)酵有著能耗低，產(chǎn)率高，污染小，后處理加工方便等優(yōu)點。本試驗利用固態(tài)發(fā)酵復方中草藥的方法來研制新型飼料添加劑，為替代飼用抗生素提供一定的參考。

4 結(jié)論

發(fā)酵復方中草藥（馬齒莧、黃芪、黨參、麥芽、木香）的最佳工藝組合為：料水比1∶0.5，接菌量4%，時間48 h，溫度37℃。此條件下發(fā)酵復方中草藥提高多糖含量效果明顯。