SLCO1B1基因多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥的關系▲

陸岸鋒 鐘丹妮 謝湘芝

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，南寧市 530021，E-mail:luanfeng301301@163．com)

新生兒高膽紅素血癥(簡稱高膽)是我國新生兒住院的主要原因，但目前仍有較多病例病因不明。近年研究表明新生兒高膽與遺傳因素存在密切關系［1］。有機陰離子轉(zhuǎn)運因子2(organic anion transporter 2，OATP2)是一種肝細胞基底膜上轉(zhuǎn)運膽紅素等物質(zhì)的重要轉(zhuǎn)運體，由有機陰離子轉(zhuǎn)運體1B1(solute carrier organic anion transporter family member 1B1，SLCO1B1)基因編碼。SLCO1B1基因突變可抑制OATP2轉(zhuǎn)運膽紅素入肝的能力，使膽紅素清除減慢，未結合膽紅素在體內(nèi)積聚致新生兒高膽。近來研究顯示，SLCO1B1基因多態(tài)性可能與新生兒高膽發(fā)生相關。本研究檢測SLCO1B1基因SLCO1B1 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597C/T 這4個突變位點，旨在探討SLCO1B1基因不同突變類型與本地區(qū)不明原因新生兒高膽之間的關系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 納入標準:廣西籍(即父母均是廣西人)足月新生兒，日齡2 ～14 d，出生體重2．5 ～4．0 kg;經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患兒家屬簽署知情同意書。病例組:收集2012年1月至2013年12月我院新生兒科收治的高膽新生兒 121例，男 65例，女 56例，出生體重(3 196．0 ±360．0)g，胎齡(272．7 ±8．2)d，日齡(4．5 ±2．8)d;母乳喂養(yǎng)108例，人工喂養(yǎng)13例;黃疸發(fā)病時間在出生2周以內(nèi)，膽紅素水平達到美國兒科學會指南［2］推薦的大于35周胎齡新生兒光療干預標準。以間接膽紅素升高為主，經(jīng)光療及藥物治療黃疸消退出院。對照組:同期隨機選取87例在我院產(chǎn)科出生的健康新生兒，在醫(yī)院觀察3～5 d，出院后隨訪至2周，出生后無黃疸或膽紅素值均低于光療干預標準，其中男57例，女30例，出生體重(3 107．0 ±411．0)g，胎齡(272．6 ±8．5)d，日齡(3．6±3．2)d，母乳喂養(yǎng)78例，人工喂養(yǎng)9例。排除早產(chǎn)兒、先天畸形、母嬰血型不合導致的溶血、G-6PD缺乏、低出生體重兒、缺氧窒息、巨大兒、敗血癥兒、頭顱血腫、低血糖、消化道畸形、紅細胞增多癥及母親妊娠期間合并妊高征、貧血、感染、糖尿病等影響黃疸程度的因素。兩組間性別、出生體重、胎齡、日齡、喂養(yǎng)方式等差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取:采集新生兒外周血2 ml以EDTA抗凝，應用血液基因組提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取基因組DNA。

1．2．2 引物設計:參考文獻［3-4］及設計擴增SLCO1B1基因第5、6外顯子共2對引物，見表1。

表1 SLCO1B1基因擴增引物

1．2．3 聚合酶鏈式反應(PCR):PCR 反應總體積50 μl，PCR反應程序為94℃預變性5min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，循環(huán) 36 次，72℃終延伸5 min。反應產(chǎn)物5 μl在用溴乙啶染色的2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察，鑒定產(chǎn)物。

1．2．4 酶切產(chǎn)物及分析:取擴增 c．388A/G的 PCR產(chǎn)物10 μl用Fermentas內(nèi)切酶TaqI 65℃消化5 h。取酶切產(chǎn)物10 μl，3．5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外燈觀察結果。

1．2．5 PCR 產(chǎn)物測序:將擴增 c．521T/C、c．571T/C 及c．597C/T的合格PCR反應產(chǎn)物進行正向測序(北京六合華大基因科技股份有限公司)，測序結果與基因文庫中的SLCO1B1基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)有突變的產(chǎn)物即進行反向測序，以保證結果的可靠性。

1．3 統(tǒng)計學分析 用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，基因型頻率、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗或者確切概率法。計量資料以(x±s)表示，采用方差分析?；蚨鄳B(tài)性對新生兒高膽影響的優(yōu)勢比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(CI)用二分類變量logistic回歸分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 SLCO1B1 c．388A/G基因分型 PCR產(chǎn)物長度為214 bp，根據(jù)酶切產(chǎn)物片段大小分為3種基因型:151，63 bp的為野生型(AA 型);151，128，63，23 bp 的為雜合子(AG型);128，63，23 bp的為突變純合子(GG 型)，見圖1。

圖1 SLCO1B1 c．388A/G位點酶切電泳圖(第1條帶為GG純合子，第2條帶為AG雜合子，第3條帶為AA野生型，第4條帶為50 bp DNA marker)。

2．2 SLCO1B1各突變位點的基因分布及等位基因頻率分析 病例組和對照組 SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及c．597C/T的基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，見表2～5。提示單一存在的SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及c．597C/T突變可能與本地區(qū)新生兒高膽的發(fā)病無關。

表2 兩組SLCO1B1 c．388A/G位點的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

表3 兩組SLCO1B1 c．521T/C位點的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

表4 兩組SLCO1B1 c．571T/C位點的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

表5 兩組SLCO1B1 c．597C/T位點的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

2．3 SLCO1B1基因多態(tài)性對新生兒高膽發(fā)生的影響

SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C 及 c．597C/T 突變與新生兒高膽紅素血癥發(fā)生無相關性(P＞0．05)，見表6。

表6 SLCO1B1不同位點基因突變對新生兒高膽發(fā)生的影響(n，%)

2．4 SLCO1B1不同基因型組患兒總膽紅素(TBIL)、結合膽紅素(DBIL)、未結合膽紅素水平(UCB)比較 在SLCO1B1 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及 c．597C/T同一位點的不同基因型中，TBIL、DBIL、UCB水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0．05)，見表7。

表7 SLCO1B1不同基因型高膽紅素血癥患兒TBIL、DBIL、UCB 水平比較(x ± s，μmol/L)

3 討論

OATP是一類重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，由有機陰離子轉(zhuǎn)運體基因(SLCO)編碼，含有643～722個氨基酸，參與膽紅素等內(nèi)、外源性物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運［5］。人類的OATP被分為6個家族(OATP1-OATP6)，OATP2又稱 OATP1B1，是一種重要的肝特異性轉(zhuǎn)運體，由SLCO1B1基因編碼(曾用OATP2基因表示)。SLCO1B1基因位于染色體12p12，全長108．59 kb，包括15個外顯子和14個內(nèi)含子，編碼2 791 bp mRNA［5］。早在 2001 年，Tirona 等［6］的實驗表明SLCO1B1基因突變使基因在漿膜表達的減少導致OATP2轉(zhuǎn)運活性的降低，未結合膽紅素未能轉(zhuǎn)運至肝臟而在體內(nèi)積聚引起新生兒高膽。目前發(fā)現(xiàn)c．388A/G和c．521T/C是東方人的主要基因突變類型。c．388A/G在中國、馬來西亞、印度足月新生兒的突變率分別為79．5% 、78．2% 、54．2%［7］，高于巴西人群(白人 50．4% ，黑人 35．1%)［8］。在本研究人群中，c．388A/G 突變率為92．8%，明顯高于上述人群。據(jù)報告c．521T/C在中國人群的突變頻率為 14．0%［9］，而在高加索人群為 20．2%［10］。本研究顯示c．521T/C的總突變率為26．0%，亦較上述人群的突變率高。而c．571T/C、c．597C/T突變率亦較 Jada等［11］報告亞洲人群的26．0%、50．0%頻率高，但 c．571T/C的突變頻率低于健康高加索人群(53．2%)［10］。這提示本地區(qū)人群存在SLCO1B1基因多態(tài)性，且其突變頻率分布呈現(xiàn)地域差異性。

SLCO1B1基因突變與新生兒高膽紅素血癥的關系為國內(nèi)外研究的熱點，但目前的研究結果仍存在差異。2005年Huang［1］發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因 A388G和T521C突變是臺灣地區(qū)人群發(fā)生高未結合膽紅素血癥的危險因素。田桂英等［12］報告SLCO1B1基因Asn130Asp(A388G突變)多態(tài)性與新生兒黃疸顯著相關，攜帶Asp突變基因型新生兒發(fā)生黃疸危險增加。2013年Liu等［13］研究顯示SLCO1B1的388位點突變與中國新生兒黃疸有關。但也有部分結果提示SLCO1B1基因突變與新生兒黃疸無關，傅雯萍等［14］報告單一存在的SLCO1B1 A388G基因突變與新生兒高膽發(fā)病無關。Prachukthum等［15］亦指出SLCO1B1基因A388G及C463A突變與新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生沒有相關性，Wong等［16］研究表明SLCO1B1突變不是馬來西亞新生兒重癥高膽紅素血癥的危險因素。本研究結果顯示病例組與對照組各突變位點基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，提示單一存在的 SLCO1B1 基 因 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597C/T突變可能與本地區(qū)人群新生兒高膽發(fā)病無關，與傅雯萍等［14］及 Wong 等［16］的研究結果相似。

姜敏等［17］研究結果提示，SLCO1B1基因388位點突變并不一定影響高膽紅素血癥的膽紅素水平。而張海霞等［3］發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因的T521C多態(tài)性在新生兒高膽紅素血癥患兒中存在明顯差異，A388G多態(tài)性顯著影響新生兒高膽紅素血癥患兒血清膽紅素水平。本研究結果顯示，在121例高膽紅素血癥新生兒中，同一突變位點不同基因型的總膽紅素水平、未結合膽紅素水平及直接膽紅素水平比較，差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，提示單一存在的SLCO1B1各基因型可能對本地區(qū)新生兒高膽的黃疸程度影響不大，與姜敏等［17］研究結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因各位點突變頻率較高，但單一存在的 SLCO1B1 基因 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597 C/T突變可能與本地區(qū)新生兒高膽紅素血癥發(fā)病無關，SLCO1B1基因同一突變位點不同基因型可能對高膽紅素血癥患兒血清膽紅素水平影響不大。SLCO1B1各基因型對高膽紅素血癥發(fā)病及黃疸程度的影響可能因研究的地區(qū)及人群不同而存在差異，同時基因突變頻率的差異隨樣本例數(shù)的增多而更真實可靠。目前已知尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)突變及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6PD)缺乏是新生兒高膽的危險因素，當SLCO1B1突變與UGT1A1突變或是G-6PD缺乏共存時，是否對新生兒高膽的黃疸程度產(chǎn)生累積或協(xié)同效應，仍有待更多的大樣本的病例對照研究予以證實。

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