以葡聚糖為載體亮氨酸修飾的磁共振造影劑合成

□ 張曉輝

葡聚糖是由葡萄糖聚合而成的一類水溶性多聚糖。它由于具有分子量大、分布的范圍比較廣、沒有毒性、水溶性好、具有一定的降解作用、有著良好的生物相容性以及能夠在血液中長(zhǎng)時(shí)間停留的特點(diǎn)。將大分子葡聚糖與常用的小分子造影劑Gd-DOTA，Gd-DTPA連接，能夠大大提高在臨床醫(yī)學(xué)上的弛豫效率與水溶性。

一、實(shí)驗(yàn)部分

(一)儀器與試劑。儀器:用質(zhì)譜測(cè)出分子結(jié)構(gòu)，紅外光譜儀，KBr壓片。在核磁譜儀上測(cè)出水分子氫核的弛豫時(shí)間(T1)。樣品在凍干機(jī)上凍干。試劑:四氮雜環(huán)十二烷，氯乙酸，氫氧化鉀，甲醇，EEDQ，乙二胺，乙二胺四乙酸二鈉，亮氨酸，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)，葡聚糖，均為分析純。

(二)DOTA-OSSu活性酯的合成。將3g的DOTA溶于15ml去離子水中，在 5°C 以下加入 2．0g EDC·HCl和 1．5g sulfo-NHS反應(yīng)24小時(shí)，活化50min后得到DOTA的活性酯DOTA-OSSu。

(三)以葡聚糖為載體的 MRI造影劑的合成。Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU的合成路線

1．羧甲基葡聚糖的合成(CMD)。根據(jù)參考文獻(xiàn)合成CMD，將2g葡聚糖溶于12mL 6 mol·L-1的NaOH溶液中，在0°C條件下攪拌40min后加入20mL異丙醇和4g一氯乙酸，將溫度升到65°C后攪拌120min，減壓抽濾除去異丙醇溶劑，用截留分子量為6000～8000的透析袋透析4天，將所透析的溶液在60°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積，凍干后得到CMD。

2．CMD與亮氨酸酰的胺化反應(yīng)(CMD-LEU)。將2g羧甲基葡聚糖溶于10ml去離子水中，在5°C下加入1g活化劑sulfo-NHS和2g脫水劑EDC·HCl，活化50min。將亮氨酸溶于10ml去離子水中，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到8，滴加到被活化的羧甲基葡聚糖溶液中，反應(yīng)24小時(shí)。用去離子水透析四天，將透析后的溶液于60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積凍干，得到CMD-LEU。

3．CMD-LEU與乙二胺的酰胺化反應(yīng)(CMD-LEUEDA)。將2g CMD-LEU溶于5ml去離子水中，配制2mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH到3。準(zhǔn)確稱量2．4g EEDQ溶解在6ml甲醇溶液中，50min后將6ml甲醇溶液滴加到CMD-LEU溶液中，在25°C水浴中攪拌50min后加入6ml乙二胺反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入50ml甲醇溶液，出現(xiàn)白色沉淀，放于冰箱中過夜，抽濾收集白色沉淀，加入2ml去離子水透析四天后凍干。

4．CMD-LEU-EDA修飾的DOTA大分子配體的合成(DOTA-EDA-CMD-LEU)。將4g DOTA溶于10ml去離子水中，在60°C條件下攪拌溶解，加入2g活化劑sulfo-NHS和1g脫水劑EDC·HCl，活化50min，將2g CMD-LEU-EDA溶于12ml去離子水中，用膠頭滴管將CMD-LEU-EDA滴加到DOTA的活化酯中，在5°C條件下反應(yīng)24小時(shí)，透析4天后凍干。

5．CMD-LEU-EDA修飾的Gd-DOTA配合物的合成(Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU)。將CMD-LEU-EDA溶于10ml去離子水，加入20ml 2．49*10-2mol/L的 GdCl3溶液，在25°C水浴中攪拌24小時(shí)，用1mol/L的NaOH溶解調(diào)節(jié)pH到6，反應(yīng)完畢后先不要停止反應(yīng)，加入兩滴二甲基酚橙溶液做指示劑，用5mol/L的EDTA進(jìn)行絡(luò)合滴定，滴加至二甲基酚橙溶液由紅色變?yōu)槊鼽S色為止。

圖1 (a)Dextran(b)CMD(c)CMD-LEU(d)CMD-LEU-EDA(e)CMD-LEU-EDA-DOTA的紅外圖

(四)以葡聚糖為載體的MRI造影劑的表征。在葡聚糖T-40的紅外譜圖中，3200～3650cm-1范圍內(nèi)產(chǎn)生H-O的伸縮振動(dòng)吸收峰，譜帶較強(qiáng)。在1647cm-1附近出現(xiàn)的比較的強(qiáng)尖峰是多糖中結(jié)晶水的吸收峰，與葡聚糖T-40的紅外譜圖相對(duì)比，CMD在1600cm-1附近出現(xiàn)了COO-的振動(dòng)吸收峰，說明葡聚糖T-40發(fā)生羧甲基化反應(yīng)得到了產(chǎn)物CMD。高波數(shù)1658cm-1附近出現(xiàn)的峰為酰胺鍵的吸收峰，證明成功連接上亮氨酸。從1668cm-1附近出現(xiàn)的酰胺鍵的吸收峰可以得出乙二胺被順利連接上了。因?yàn)镈OTA的加入，在1672cm-1附近出現(xiàn)DOTA中的COO-的振動(dòng)吸收峰。由此可以得出DOTA的確是通過酰胺鍵連到了葡聚糖分子上。

圖2 Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU的弛豫效率

(五)以葡聚糖為載體的MRI造影劑的體外弛豫測(cè)定。將大分子的葡聚糖和小分子造影劑Gd-DOTA相結(jié)合，增加了旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，提高了造影劑的弛豫效率。由圖2可知Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU 在0．5～0．05mmol/L的濃度范圍發(fā)生變化時(shí)，溶劑氫核的弛豫效率也發(fā)生變化。出線性擬合，相關(guān)系數(shù)r為0．99913，它的弛豫效率為5．5mmol-1·L·s-1。如今，臨床醫(yī)學(xué)所使用的Gd-DOTA造影劑的弛豫效率 4．8mmol-1·L·s-1，Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU 的弛豫效率是Gd-DOTA的1．1倍。

二、結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)通過酰胺化反應(yīng)合成了Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU這種造影劇毒性小，水溶性好，且有一定的降解作用，其弛豫效率是小分子弛豫效率Gd-DOTA的1．1倍。這種造影劑有著良好的發(fā)展前景，但是在體內(nèi)的藥物代謝的分布仍需要進(jìn)一步研究。

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