人乳腺癌干細(xì)胞異種移植動(dòng)物模型研究進(jìn)展

人乳腺癌干細(xì)胞異種移植動(dòng)物模型研究進(jìn)展

戴璟，謝茂云 綜述，黃耀*審閱

(廣東醫(yī)學(xué)院福田醫(yī)院 外科,廣東 深圳518048)

乳腺癌作為一種嚴(yán)重威脅女性健康和生命安全的惡性腫瘤[1]。近45年來，乳腺癌的發(fā)病率在世界各國均呈上升趨勢[2]。全世界每年新發(fā)乳腺癌約100萬例，死亡約60萬例[3]。乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)及生物科學(xué)研究的“熱點(diǎn)”。干細(xì)胞或祖細(xì)胞已有研究證明在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中成為惡性轉(zhuǎn)化靶點(diǎn)的關(guān)鍵。腫瘤干細(xì)胞主要通過Notch,Wnt,Hedgehog等三條通路調(diào)解自我更新的信號傳導(dǎo)[4-8]，如Notch途徑的激活會導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的改變；wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活促進(jìn)了上皮干細(xì)胞向上皮癌轉(zhuǎn)化；Hedgehog信號通路在大多數(shù)乳腺癌中被激活，過度表達(dá)PTC1和GLI1(Hedgehog信號通路激活標(biāo)記物)。上述通路的異常會導(dǎo)致正常乳腺的干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，致使乳腺癌的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型已今已成為是研究乳腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的重要工具之一。

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

異種移植模型：人類乳腺癌細(xì)胞株移植于免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)而建立的動(dòng)物模型[9]。免疫缺陷動(dòng)物本身具有腫瘤移植成功率高，需求細(xì)胞數(shù)目少；移植瘤的病理學(xué)、生物學(xué)特征更接近人體的原發(fā)瘤等特點(diǎn)。人乳腺癌異種移植主要選取的動(dòng)物有重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠、裸鼠[10]。

1.1SCID小鼠模型鑒于SCID小鼠缺乏T和B淋巴細(xì)胞的特點(diǎn)，對體外移植物免疫排斥能力較低，為國內(nèi)外學(xué)者在腫瘤生物學(xué)研究方面引起普遍重視。SCID小鼠建立的移植動(dòng)物模型已廣泛見于T和B細(xì)胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸粘液腺癌和肺癌等。上述研究結(jié)果均顯示SCID小鼠造模優(yōu)于裸鼠[11-13]。葉麗虹等采用經(jīng)胰酶消化的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞懸液接種于SCID小鼠腋背皮下，每只接種0.2 ml，6-10天接種部位出現(xiàn)質(zhì)硬腫瘤結(jié)節(jié)，成瘤率為5/5只，成瘤潛伏期為(7．4±1．3)d[14]。

1.2NOD/SCID小鼠非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交后獲得NOD/SCID小鼠[15]。Beckhove等將MCF-7細(xì)胞株移植入NOD/Lt-SCID小鼠體內(nèi)，不經(jīng)射線照射，成瘤率大于 90%，經(jīng)觀察數(shù)天瘤體內(nèi)顯示有新生血管生成，各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)呈正相關(guān)性變化，建立了較好的模擬腫瘤的生長環(huán)境，提供檢測新的抗癌治療方式或藥物的良好模型[16]。

1.3裸鼠胰酶消化后的MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞，用Hank液清洗2次，錐蟲藍(lán)染色，于雌性裸鼠左側(cè)腋窩皮下接種0.2 ml/只。MDA-MB-231移植瘤5天潛伏期后，接種皮下可見灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤接種成功率為90%。SK-BR-3移植瘤11 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤接種成活率80%[17]。朱瑋等將攜帶熒光素的酶(leu)基因的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-lue于裸鼠下腹部乳腺脂肪墊內(nèi)注射50 μl，裸鼠腹腔注射熒光素，進(jìn)行光學(xué)成像檢測。第7天時(shí)活體內(nèi)可見明顯發(fā)光，10天可見腫瘤病灶，腫瘤的平均體積在第2周到第5周時(shí)都呈上升趨勢，對腫瘤體積和光子數(shù)進(jìn)行回歸分析，R2=0．901[18]。

2異種移植的制備方法

2.1人乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與分離

2.1.1在對人乳腺癌干細(xì)胞的研究中的發(fā)現(xiàn)：乳腺癌干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)存在自我更新及多向分化性潛能的細(xì)胞群體，可分化產(chǎn)生相應(yīng)組織的成熟細(xì)胞，一個(gè)干細(xì)胞可通過對稱和非對稱分裂一個(gè)干細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞，一個(gè)與母細(xì)胞完全一致，具有母細(xì)胞同樣的特征，故理論上可以發(fā)育成為完整的生物個(gè)體或組織器官[19]。腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells，TSCs)作為一種特殊類型的干細(xì)胞，其本身已具有：增殖能力高、自身的更新能力及多向分化等功能[19]。腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞在其各自的生長過程中存在相關(guān)的調(diào)控機(jī)制,其中Wnt、Hedgehog、Notch通路的某些信號調(diào)節(jié)及傳導(dǎo)異常最終導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生[4-8]。AL-Hajj等首次發(fā)現(xiàn)了乳腺癌起源于癌干細(xì)胞的證據(jù)[21]，通過對人乳腺癌組織的分離，檢出表面有CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-標(biāo)志的細(xì)胞,將這些細(xì)胞移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi),證實(shí)了能夠產(chǎn)生明顯腫瘤的細(xì)胞亞群的存在，提示乳腺癌中存在促進(jìn)腫瘤發(fā)展的腫瘤干細(xì)胞。

2.1.2人乳腺癌干細(xì)胞的分離人乳腺癌干細(xì)胞分離方面具有較多的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)方式，如通常采用的乳腺癌干細(xì)胞的分離方法：表面標(biāo)志分選、流式細(xì)胞儀側(cè)群分流、無血清懸浮培養(yǎng)等方法[22]。AL-Hajj等首次分離出表面標(biāo)志為CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-的實(shí)體腫瘤干細(xì)胞[21]。Liu[23]等利用表面標(biāo)志CD44+、CD24-/low的細(xì)胞檢測乳腺癌患者預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞與患者的生存期和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)。在長時(shí)間的體外培育中，人乳腺癌干細(xì)胞在培育過程中其表面標(biāo)志物發(fā)生改變。研究者又從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系分離出CD55high、CD55low細(xì)胞，其中CD55high細(xì)胞具有分化能力進(jìn)一步加強(qiáng)趨勢，展現(xiàn)CD55high細(xì)胞更具備腫瘤干細(xì)胞的生物性狀[24]。側(cè)群(side population,SP)分選利用干細(xì)胞帶有特異性膜蛋白，如ABCG2(breast cancer resistance protein)，使其不能被DNA增補(bǔ)性染料Hoechst33342染色的特點(diǎn)進(jìn)行干細(xì)胞分離。Patrawala[25]等在MCF7細(xì)胞株中分離出的SP亞群，SP亞群在致瘤性能力明顯超過非SP細(xì)胞，另SP亞群即可可傳代也可其他非SP細(xì)胞，充分顯示其具有自我更新和多向分化能力及具有癌干細(xì)胞特性。也有相關(guān)研究者應(yīng)用無血清懸浮培養(yǎng)體系進(jìn)行乳腺癌原代細(xì)胞培養(yǎng)，無需明確的細(xì)胞標(biāo)志，獲取富集乳腺癌起始細(xì)胞的被稱作“乳腺球(manlmo-sphere，MS)”的克隆性非黏附細(xì)胞集落[26]。起源于單個(gè)細(xì)胞的乳腺球能夠分化成乳腺的多種不同的細(xì)胞系。鄭文博等采用乳腺球懸浮培養(yǎng)法從人乳腺癌的腫瘤組織中成功分離并富集了原代腫瘤細(xì)胞，通過對其進(jìn)行：CD44、CD24、ALDHl，ESA以及Oct4的檢測，證實(shí)了其呈現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的表型[27]。由此可見，乳腺球懸浮培養(yǎng)法同樣能夠有效地分離并富集乳腺癌干細(xì)胞。

2.2造模方法

乳腺癌干細(xì)胞異種移植的動(dòng)物模型分：為原代移植和細(xì)胞系移植兩類[10]。AL-Hajj等通過對人乳腺癌組織分離，成功提取表面標(biāo)志為CD44+、CD24-/low、ESA+、Lin-的實(shí)體腫瘤干細(xì)胞[20],通過相應(yīng)干細(xì)胞移植免疫缺陷小鼠的乳腺組織內(nèi)經(jīng)培養(yǎng)形成腫瘤,成瘤率近100%，培植腫瘤具有原發(fā)腫瘤的病理組織學(xué)特征。乳腺癌細(xì)胞系如MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3已廣泛應(yīng)用到乳腺癌異種移植的動(dòng)物模型中[11,15,17]。乳腺癌干細(xì)胞異種移植常接種于小鼠的乳脂墊(mammary fat pad)與腋背側(cè)皮下[28-29]。Price[30]等曾對比皮下接種和乳脂墊接種的差異，利用細(xì)胞株和MDA-MB-231、MDA-MB-435分別進(jìn)行皮下注射接種和乳脂墊接種，發(fā)現(xiàn)乳脂墊接種后的成瘤率為100%，而皮下途徑為40%。

3評價(jià)與展望

目前，乳腺癌干細(xì)胞異種移植的研究仍存在一定程度的不足。由于技術(shù)上的限制，需要通過表面標(biāo)志分選、流式細(xì)胞儀側(cè)群分流等方法對乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行分離，未能找到對其富集、分離最佳方法。而異種移植模型仍存在缺乏人類乳腺癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞、缺少癌細(xì)胞周圍的三維結(jié)構(gòu)、缺少對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)等缺點(diǎn)。綜上所述，乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌的起源,而乳腺癌干細(xì)胞動(dòng)物模型的建立和研究，有助于更好地了解乳腺癌的生物學(xué)特性，選擇相應(yīng)的乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行針對性乳腺癌靶向治療,殺死腫瘤干細(xì)胞,將對乳腺癌預(yù)防、治療、預(yù)后起不可忽視的作用。

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收稿日期：(2013-11-16)

文章編號：1007-4287(2015)03-0519-03

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