結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群脫氧核糖核酸檢測(cè)試劑分析性能評(píng)估淺析

劉容枝

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·專論·

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群脫氧核糖核酸檢測(cè)試劑分析性能評(píng)估淺析

劉容枝

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)檢測(cè)試劑的分析性能評(píng)估資料是該類試劑注冊(cè)申報(bào)資料的一項(xiàng)重要的技術(shù)資料。作者總結(jié)分析性能評(píng)估資料需要包括的主要項(xiàng)目與相關(guān)的技術(shù)細(xì)節(jié)，指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)科學(xué)合理地進(jìn)行試劑研發(fā)。

結(jié)核分枝桿菌； DNA, 細(xì)菌； 試劑盒, 診斷

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、非洲分枝桿菌(Mycobacteriumafricanum)、卡內(nèi)蒂分枝桿菌(Mycobacteriumcanetti)、羊分枝桿菌(Mycobacteriumcaprae)和田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti)。在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，除田鼠分枝桿菌對(duì)人無致病力外，其他幾種菌均可致病，產(chǎn)生相同的臨床表現(xiàn)和大體相同的對(duì)藥物的敏感度譜型。因此，臨床上往往只作結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定而無須進(jìn)行種水平的鑒定[1]。

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)檢測(cè)試劑是指利用PCR核酸檢測(cè)技術(shù)，以特定的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的基因序列為檢測(cè)目標(biāo)，對(duì)人痰液等呼吸道樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑，用于結(jié)核病患者的輔助診斷。

分析性能評(píng)估資料是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料的非常重要的一項(xiàng)技術(shù)資料[2]。參考美國食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)文件[3]，結(jié)合審評(píng)中對(duì)國內(nèi)外企業(yè)有關(guān)該部分資料的理解與總結(jié)[4-7]，現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群DNA檢測(cè)試劑的分析性能研究提出如下建議。

最低檢測(cè)限

一、最低檢測(cè)限的確定

建議使用結(jié)核分枝桿菌、BCG(如適用)的梯度稀釋液來確定最低檢測(cè)限。每個(gè)梯度的稀釋液重復(fù)3～5份，每份進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，將具有95%陽性檢出率的菌株濃度作為最低檢測(cè)限。應(yīng)明確每份菌株的來源、基因型和表型特性，如來源于美國菌種保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)等，菌株的基因組中含有多少拷貝的被測(cè)靶基因等信息。建議采用鋪板并計(jì)數(shù)細(xì)菌集落形成單位(colony-forming units，CFU)的方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)。應(yīng)采用實(shí)際鋪板并對(duì)細(xì)菌集落進(jìn)行計(jì)數(shù)的方式來確定細(xì)菌集落形成單位，而不是通過推理計(jì)算來估計(jì)菌株濃度(如麥?zhǔn)蠁挝?。

實(shí)際操作中，建議將已知濃度的菌株與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性的痰樣本進(jìn)行混合后，完全按照試劑盒的操作方法對(duì)此“制備痰樣本”進(jìn)行樣本前處理(如液化)、核酸提取擴(kuò)增等。對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用培養(yǎng)鑒定、臨床診斷、已上市試劑盒和檢測(cè)試劑進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。

具體操作如下。(1)液化：在痰液中加入1～2倍體積的4%氫氧化鈉(NaOH)溶液，混勻，室溫下放置20 min，使其充分液化。(2)洗滌：取1 ml液化后痰液至1.5 ml離心管，10 000×g離心10 min，盡可能完全傾倒上清；沉淀用1 ml生理鹽水懸浮，同上離心條件洗滌2次。(3)提?。合蚝恋砦锏碾x心管中加入5 μl DNA提取液，混勻，沸水浴10 min，然后冷卻至室溫；10 000×g離心>5 min，吸取上清液作為模板備用。

具體而言，向“菌株與陰性痰液的混合物”中加入1～2倍混合物體積的4%氫氧化鈉溶液，液化、洗滌后提取DNA。

二、最低檢測(cè)限的驗(yàn)證

建議在最低檢測(cè)限的菌株濃度對(duì)結(jié)核分枝桿菌、BCG(如適用)進(jìn)行至少20次的重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，每種菌株的陽性檢出率應(yīng)至少為95%。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測(cè)限驗(yàn)證的各個(gè)菌株的來源、表型及濃度等信息。建議在最低檢測(cè)限的核酸濃度對(duì)上述菌株的核酸進(jìn)行至少20次的重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，每種菌株的核酸的陽性檢出率應(yīng)至少為95%。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測(cè)限驗(yàn)證的各種臨床菌株的核酸的來源及濃度等信息。

分析特異度

一、交叉反應(yīng)

用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。包括：非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)、常見的口腔和呼吸道共生的病原菌等，具體目錄如下。

1.用于交叉反應(yīng)性研究的其他分枝桿菌(非結(jié)核分枝桿菌)：亞洲分枝桿菌(Mycobacteriumasiaticum)、嗜血分枝桿菌(Mycobacteriumhaemophilum)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)、瑪爾摩分枝桿菌(Mycobacteriummalmoenes)、海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae)、猿猴分枝桿菌(Mycobacteriumsimiae)、偶然分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)、微黃分枝桿菌(Mycobacteriumflavescens)、土地分枝桿菌(Mycobacteriumterrae)、戈登分枝桿菌(Mycobacteriumgordonae)、施氏分枝桿菌(Mycobacteriumshimodii)、蟾蜍分枝桿菌(Mycobacteriumxenopi)、耐熱分枝桿菌(Mycobacteriumthermoresistible)、鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacteriumulcerans)、胃分枝桿菌(Mycobacteriumgastri)、膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)、瘰疬分枝桿菌(Mycobacteriumscrofulaceum)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)、隱藏分枝桿菌(Mycobacteriumcelatum)、日內(nèi)瓦分枝桿菌(Mycobacteriumgenavense)、產(chǎn)黏液分枝桿菌(Mycobacteriummucogenicum)、次要分枝桿菌(Mycobacteriumtriviale)、蘇加分枝桿菌(Mycobacteriumszulgai)。

2.用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體：肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、黏膜炎莫拉菌(Mucositismorabacteria)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸埃希菌(EscherichiaColi)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、副百日咳博德特菌(Bordetellaparapertussis)、巴西諾卡菌(Nocardiabrasiliensis)、北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)、甲型溶血性鏈球菌(Alphahemolyticstreptococcus)、乙型溶血性鏈球菌(Betahemolyticstreptococcus)、沙門菌(Salmonella)、副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、百日咳博德菌(Bordetellapertussis)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)。

3.建議在病原體感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證：應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體的來源、種屬和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。其中，濃度應(yīng)是實(shí)際計(jì)數(shù)獲得的濃度，而非理論計(jì)算得到的濃度(如麥?zhǔn)蠁挝换蛘呶舛戎?。實(shí)際操作中，建議將已知濃度的菌株與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性的痰樣本進(jìn)行混合，并完全按照試劑盒的操作方法對(duì)此“痰樣本”進(jìn)行樣本前處理、核酸提取擴(kuò)增等。對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用培養(yǎng)鑒定、臨床診斷、已上市試劑盒和檢測(cè)試劑進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。

為了確認(rèn)高濃度的非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群是否對(duì)低濃度的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群產(chǎn)生干擾，建議將已知濃度的非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、結(jié)核分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性的痰樣本進(jìn)行混合，并完全按照試劑盒的操作方法對(duì)此“痰樣本”進(jìn)行樣本前處理、核酸提取擴(kuò)增等。建議采用如下非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)該項(xiàng)目：鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)和瑪爾摩分枝桿菌(Mycobacteriummalmoenes)。

二、干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)(如：血液、黏液或人細(xì)胞)；外源性物質(zhì)(鼻用藥物、咽喉用藥物，以及口服藥物)和結(jié)核病治療中常使用的藥物。建議使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證。另外，建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于常見藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。建議在結(jié)核分枝桿菌或牛結(jié)核分枝桿菌的最低檢測(cè)限濃度水平對(duì)每種干擾物質(zhì)的影響進(jìn)行研究。

建議用于干擾研究的物質(zhì)目錄如下：異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、利福平、卡那霉素、鏈霉素、卷曲霉素、丁胺卡那霉素、人細(xì)胞、過敏性癥狀緩解藥物、血液、口服麻醉劑和鎮(zhèn)痛劑、抗生素、抗病毒藥、鼻腔噴霧劑或滴鼻劑和鼻腔糖皮質(zhì)激素。

精 密 度

測(cè)量精密度的評(píng)價(jià)方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì)本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)，主要包括以下要求：(1)對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑(包括提取組分和PCR組分)本身的影響外，還應(yīng)對(duì)PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。(2)合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少12 d的檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間，以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。(3)建議將“結(jié)核分枝桿菌菌株與臨床陰性痰樣本混合物”作為樣本，在以下3個(gè)濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，具體方法可參考本指導(dǎo)原則的“最低檢測(cè)限的確定”部分內(nèi)容：①陰性樣本：不含分析物的樣本，陰性檢出率應(yīng)為100%(檢測(cè)次數(shù)≥20)。②弱陽性樣本：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的最低檢測(cè)限，陽性檢出率應(yīng)高于95%(檢測(cè)次數(shù)≥20)。③中等陽性樣本：待測(cè)物濃度約為最低檢測(cè)限的2倍或3倍，陽性檢出率為100%(檢測(cè)次數(shù)≥20)。

反應(yīng)性(包容性)

應(yīng)證明檢測(cè)試劑可以檢測(cè)代表世界不同基因多態(tài)性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株。應(yīng)采用略高于最低檢出限濃度的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株進(jìn)行研究。應(yīng)能夠提供各個(gè)菌株的來源、菌株特性及濃度確認(rèn)試驗(yàn)等信息。應(yīng)采用權(quán)威的科學(xué)機(jī)構(gòu)認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)參考方法：如結(jié)核分枝桿菌多位點(diǎn)的數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number of tandem repeat,MIRU-VNTR)；間隔區(qū)寡聚核苷酸分型技術(shù)(Spoligotyping)確認(rèn)菌株特性。需提交科學(xué)文獻(xiàn)，以證明所有采用的菌株含有目的靶基因。

對(duì)于某些難于培養(yǎng)或者因?yàn)樯锇踩栽驘o法培養(yǎng)的菌株，可采用菌株的核酸提取樣本進(jìn)行包容性的驗(yàn)證。

[1] 馬玙，朱莉貞，潘毓萱. 結(jié)核?。本喝嗣裥l(wèi)生出版社，2006.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局．體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法 (國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)).2014-07-30.

[3] U.S. Food and Drug Administration. Class Ⅱ special controls guideline: nucleic acid-based in vitro diagnostic devices for the detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex in respiratory specimens—Guideline for Industry and Food and Drug Administration Staff[S/OL].(2014-05-30)[2014-12-15].http://www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedocuments/ucm357617.htm.

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(本文編輯：薛愛華)

The analytic performance studies ofMycobacteriumtuberculosisComplex DNA detection reagents

LIURong-zhi.

CenterforMedicalDeviceEvaluation，CFDA，Beijing100044,ChinaCorrespondingauthor:LIURong-zhi,Email:liurz@cmde.org.cn

The material of the analytic performance studies ofMycobacteriumtuberculosisComplex DNA detection reagents is an important technical document of the application materials for reagent registration. The main aim of this paper is to summarize the main projects and related technical details of analytic performance evaluation studies in order to guide manufactures to conduct research and development of reagents scientifically and rationally.

Mycobacteriumtuberculosis; DNA, bacterial； Reagent kits, diagnostic

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.03.018

100044 北京，國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心

劉容枝，Email: liurz@cmde.org.cn

2014-04-14)