馬西利亞分枝桿菌臨床分離株的多位點(diǎn)序列鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)分析

魏劍浩 郭倩 李桂蓮 劉海燦 李馬超 吳移謀 樓永良 呂建新 萬(wàn)康林

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·論著·

馬西利亞分枝桿菌臨床分離株的多位點(diǎn)序列鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)分析

魏劍浩 郭倩 李桂蓮 劉海燦 李馬超 吳移謀 樓永良 呂建新 萬(wàn)康林

目的 對(duì)單基因比對(duì)不能區(qū)分的馬西利亞分枝桿菌(M.massiliense)臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定，補(bǔ)充其藥物敏感譜，為臨床診治提供依據(jù)。 方法 2013年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室共收集了47例疑似非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染的臨床樣本，用對(duì)硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基和多位點(diǎn)PCR方法區(qū)分鑒別得到的分枝桿菌，采用基因序列比對(duì)進(jìn)行NTM菌種鑒定，其中未能準(zhǔn)確鑒定菌種的6株臨床分離株進(jìn)一步通過(guò)多位點(diǎn)序列分析(MLSA)方法進(jìn)行定種鑒定。采用微孔板阿爾瑪藍(lán)測(cè)定法(MABA)對(duì)馬西利亞分枝桿菌菌株開(kāi)展36種藥物的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)“)。 結(jié)果 47例臨床樣本中鑒定出34株NTM，其中6株臨床分離株綜合5個(gè)管家基因(16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA)的單基因比對(duì)結(jié)果仍不能鑒定菌種，因此本研究采用MLSA方法構(gòu)建鄰位相加法進(jìn)化樹(shù)確認(rèn)6株均為馬西利亞分枝桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示M.massiliense對(duì)阿米卡星為敏感(16 μg/ml)或中度敏感(32 μg/ml)，對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸、氧氟沙星、卡那霉素、環(huán)絲氨酸、美羅培南、米諾環(huán)素12種藥物耐藥。 結(jié)論 MLSA方法能有效鑒定馬西利亞分枝桿菌；馬西利亞分枝桿菌耐藥程度較高。

分枝桿菌屬; 多位點(diǎn)測(cè)序分型； 微生物敏感性試驗(yàn)

馬西利亞分枝桿菌(Mycobacteriummassiliense，M.massiliense)屬于膿腫分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumabscessuscomplex)，首次報(bào)道于2004年，由Adékambi等[1]從一位50周歲的女性患者的血痰中分離到該菌并對(duì)其命名。目前有報(bào)道的馬西利亞分枝桿菌感染患者并不多見(jiàn)，相關(guān)的試驗(yàn)研究也不甚清楚，因此少數(shù)臨床分離株仍有比較分析的必要。多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)是近年來(lái)興起的一種新的分類學(xué)方法，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道應(yīng)用于各類細(xì)菌的菌種鑒定[2-6]，但國(guó)內(nèi)用于非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous Mycobacteria，NTM)的研究卻少有報(bào)道。MLSA通過(guò)多基因位點(diǎn)的組合，能夠更加直觀、準(zhǔn)確地將種類繁多的NTM進(jìn)行菌種鑒定。本研究以2013年間中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室鑒定分離的NTM臨床分離株中疑似馬西利亞分枝桿菌的樣本為研究對(duì)象，擴(kuò)增測(cè)序16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA5個(gè)管家基因位點(diǎn)[5, 7]，采用MLSA的方法最終確定6株馬西利亞分枝桿菌，并進(jìn)一步結(jié)合馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株DSM 45103進(jìn)行微孔板阿爾瑪藍(lán)測(cè)定法(microplate Alamarblue assay，MABA)對(duì)36種抗結(jié)核藥物進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，補(bǔ)充了馬西利亞分枝桿菌對(duì)這些藥物的敏感性數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

2013年間中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室共接收到47例高度疑似NTM感染(分離培養(yǎng)后得到NTM、線型探針等技術(shù)檢測(cè)疑似為NTM及診斷為“結(jié)核病”后治療無(wú)效或效果不佳等情況)患者的臨床樣本，經(jīng)初步培養(yǎng)鑒定后，分離到8株結(jié)核分枝桿菌，1株牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)，34株NTM。NTM臨床分離株中最終確定了6株馬西利亞分枝桿菌。其中湖南省結(jié)核病防治所2例，長(zhǎng)春市傳染病醫(yī)院、福建省胸科醫(yī)院、北京市胸科醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院各1例。馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株DSM 45103購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganis-men und Zellkulturen，DSMZ)。所有菌株均由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存并提供。

二、方法

(一)NTM篩選

本室接收的樣本經(jīng)過(guò)前處理后接種于改良羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)上，37 ℃培養(yǎng)4周后累計(jì)分離到43株臨床分離株。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，經(jīng)磨菌比濁制備成10-2mg/ml菌懸液，分別接種0.1 ml于對(duì)硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)和噻吩-2-羧酸肼(2-thiophene carboxylic acid hydrazide，TCH)培養(yǎng)基上并記錄生長(zhǎng)情況，同時(shí)能在PNB和TCH培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株劃歸為NTM[8]。同時(shí)結(jié)合多位點(diǎn)PCR方法進(jìn)行菌種鑒定[9]，綜合2種方法的結(jié)果分離到34株NTM。

(二)初步鑒定菌種

采用水煮法提取NTM菌株DNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆肹10]。擴(kuò)增測(cè)序hsp65和rpoB2個(gè)管家基因位點(diǎn)的序列信息，擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增體系為50 μl：10 μmol/L引物各2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，DNA模板5 μl，雙蒸水(ddH2O)16 μl；陰性對(duì)照體系中不加DNA模板，ddH2O 21 μl，其他不變。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，并將基因序列提交美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)。

表1 馬西利亞分枝桿菌感染患者情況

(三)多位點(diǎn)序列分析定種鑒定

選取疑似馬西利亞分枝桿菌的臨床分離株以16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA5個(gè)管家基因位點(diǎn)為目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。擴(kuò)增體系同前文述。將各位點(diǎn)的序列拼接后用分子進(jìn)化遺傳分析(MEGA)5.10軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并選取膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CIP 104536、馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CCUG 48898(與DSM 45103為同一菌株，此處為瑞典G?teborg大學(xué)菌物保藏中心編號(hào)，見(jiàn)文獻(xiàn)[1])及2株龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae，M.chelonae)標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 19237和CIP 104535作為參照，采用多位點(diǎn)序列分析方法確定菌種。膿腫分枝桿菌、馬西利亞分枝桿菌、龜分枝桿菌4株標(biāo)準(zhǔn)株的序列信息獲取自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。

表2 各基因的引物序列[5, 7]

注 “F”表示上游引物，“R”表示下游引物

(四) 藥敏試驗(yàn)

制備稀釋菌液：刮取羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好(約3周)的菌落，用生理鹽水混懸成1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?約為1 mg/ml)，然后再以1∶20的比例用液體培養(yǎng)基稀釋菌液，制成終濃度約為107CFU/ml的接種菌懸液。構(gòu)建藥物濃度梯度：在96孔板中除邊緣各孔外，每孔加入100 μl液體培養(yǎng)基，并在板中對(duì)測(cè)試藥物進(jìn)行倍比稀釋，制成表4所示相應(yīng)藥物的測(cè)試范圍。最后每孔加入100 μl接種菌懸液。同時(shí)設(shè)置不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照孔及空白對(duì)照孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀：37 ℃培養(yǎng)3 d后每孔加入70 μl顯色劑(20 μl阿爾瑪藍(lán)和50 μl 5%吐溫-80)后再孵育1 d判讀結(jié)果，其中阿米卡星、頭孢西丁和阿奇霉素藥敏試驗(yàn)于37 ℃孵育2 d后判讀結(jié)果；而克拉霉素孵育時(shí)間應(yīng)延至14 d后判讀結(jié)果。96微孔板中顏色由藍(lán)變紅提示有菌株生長(zhǎng)，沒(méi)有變色的實(shí)驗(yàn)孔中讀取到的最小藥物濃度和已發(fā)生變色的實(shí)驗(yàn)孔中讀取到的最大藥物濃度即為該實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)此藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)[11-13]。數(shù)值大小反映藥物對(duì)菌株的抑菌活性，數(shù)值越小，對(duì)應(yīng)藥物的抑菌活性越高。

本研究共選取了文獻(xiàn)中有較多報(bào)道用于分枝桿菌病治療的36種藥物開(kāi)展試驗(yàn)，并將接種菌懸液濃度稀釋為107CFU/ml。試驗(yàn)中所用藥物均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich集團(tuán)公司。

結(jié) 果

一、分枝桿菌分離鑒定

47例疑似NTM感染患者的臨床樣本經(jīng)過(guò)前處理后接種培養(yǎng)，累計(jì)成功分離到43株臨床分離株。經(jīng)PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基和多位點(diǎn)PCR方法鑒定后，34株為NTM，8株為結(jié)核分枝桿菌，1株為牛分枝桿菌。測(cè)序34株NTMhsp65、rpoB2個(gè)管家基因位點(diǎn)的序列，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)6株臨床分離株疑似為馬西利亞分枝桿菌。

表3中，hsp65基因不能有效區(qū)分鑒定馬西利亞分枝桿菌與膿腫分枝桿菌，rpoB基因僅能有效地將馬西利亞分枝桿菌和膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌區(qū)分鑒定。在進(jìn)一步補(bǔ)充測(cè)序16S rRNA、sodA和recA3個(gè)管家基因位點(diǎn)的序列并分析后，綜合5個(gè)管家基因的比對(duì)結(jié)果仍不足以確認(rèn)6株臨床分離株均為馬西利亞分枝桿菌。

因此，本研究采用MLSA方法進(jìn)一步對(duì)疑似為馬西利亞分枝桿菌的臨床分離株進(jìn)行菌種確定。綜合16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA5個(gè)管家基因位點(diǎn)的序列分析，采用鄰位相加法(Neighbor-joining method)建立進(jìn)化樹(shù)，迭代次數(shù)(bootstrap values)設(shè)定為1000，結(jié)果顯示6株臨床分離株與馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CCUG 48898具有高度的同源性，聚類于同一簇，見(jiàn)圖1。因此確定6株臨床分離株均為馬西利亞分枝桿菌。

表3 hsp65與rpoB基因比對(duì)結(jié)果

注 MM：M.massiliense；MA：M.abscessus；MC：M.chelonae

圖1 MLSA方法菌種鑒定鄰位相加法進(jìn)化樹(shù)

分析6例馬西利亞分枝桿菌感染患者情況后發(fā)現(xiàn)，咳嗽、咯痰、咯血、咽痛、頭痛、發(fā)熱是最常見(jiàn)的疾病癥狀，其中咳嗽和咯痰是這些馬西利亞分枝桿菌感染患者共有的臨床表現(xiàn)。

二、藥敏試驗(yàn)

參照快速生長(zhǎng)分枝桿菌(rapidly growingMycobacterium，RGM)體外藥物敏感試驗(yàn)參考界值[17-20]，馬西利亞分枝桿菌對(duì)氧氟沙星、卡那霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、美羅培南、米諾環(huán)素12種藥物均耐藥，對(duì)阿米卡星為敏感或中度敏感，對(duì)克拉霉素、利奈唑胺、頭孢西丁的敏感率較高(>50%)。其中6株馬西利亞分枝桿菌臨床分離株(M1～M6)對(duì)力克菲蒺、頭孢哌酮、氨硫脲、氨苯砜4種藥物高度不敏感；對(duì)氧氟沙星、卡那霉素、莫西沙星、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)絲氨酸、美羅培南、米諾環(huán)素15種藥物均耐藥，羅紅霉素、司帕沙星、四環(huán)素、加替沙星、頭孢美唑、阿奇霉素、紅霉素、利福噴丁8種藥物對(duì)臨床分離株有不同的抑制作用。與標(biāo)準(zhǔn)株的結(jié)果相比，臨床分離株對(duì)莫西沙星、利奈唑胺、利福平、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、氨苯砜6種藥物的敏感度均較馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株差，對(duì)異煙肼、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸、力克菲蒺、環(huán)絲氨酸、頭孢哌酮、米諾環(huán)素8種藥物的敏感度與馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株一致且均為耐藥或高度不敏感，M3、M4、M5菌株對(duì)頭孢吡肟的敏感度優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)株，M1、M6菌株對(duì)紅霉素的敏感度優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)株(表4)。

討 論

一、菌種鑒定與菌株分析

長(zhǎng)期以來(lái)，因?yàn)榉种U菌特殊的生長(zhǎng)特性，一直使其快速分離鑒定較為困難。隨著分子生物學(xué)研究和基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于基因序列檢測(cè)的菌種鑒定技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于分枝桿菌的菌種鑒定。近年來(lái)有研究表明，單個(gè)基因測(cè)序比對(duì)或基因的組合比對(duì)，已不能滿足現(xiàn)有的菌種鑒定需求[18-19]。單個(gè)基因序列所攜帶的遺傳信息有限，用于菌種鑒定時(shí)分辨能力也受到限制，對(duì)于該基因同源性較高的菌種甚至不能有效區(qū)分[如西瓦堤分枝桿菌(M.silvaticum)與副結(jié)核分枝桿菌(M.paratuberculosis)][20]；而基因的組合比對(duì)則可能面臨比對(duì)結(jié)果不一致的局面，特別是近些年來(lái)的研究證實(shí)在NTM菌種間存在著橫向基因轉(zhuǎn)移(lateral gene transfer，LGT)事件[如永宮分枝桿菌(M.yongonense)與副瘰疬分枝桿菌(M.parascrofulaceum)][21]。隨著hsp65、rpoB等基因在菌種鑒定中的廣泛應(yīng)用，sodA、recA等管家基因也被證明能通過(guò)片段比對(duì)區(qū)分和鑒定菌種，并有文獻(xiàn)報(bào)道了一種多位點(diǎn)序列分析(MLSA)方法鑒定分枝桿菌的新思路[2-6]。與基因位點(diǎn)的單獨(dú)比對(duì)相比，MLSA的結(jié)果更加真實(shí)高效的反應(yīng)了細(xì)菌基因組的特征，能有效避免基因單獨(dú)比對(duì)時(shí)掩蓋其他基因特征的情況，又同時(shí)避免全基因組測(cè)序的高昂成本和時(shí)間損失，因此對(duì)于種類繁多且同源性較高的NTM有較高的鑒別區(qū)分能力。針對(duì)本研究所遇到的菌種不易區(qū)分鑒定的問(wèn)題，我們選取了MLSA方法鑒定菌種。由表3可見(jiàn)，不論是初次鑒定選取的hsp65和rpoB基因還是后來(lái)補(bǔ)充的其他3種基因均不能區(qū)分馬西利亞分枝桿菌與膿腫分枝桿菌，嘗試對(duì)5個(gè)管家基因序列進(jìn)行組合也僅能將馬西利亞分枝桿菌和膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌進(jìn)行有效的鑒定區(qū)分，并不能準(zhǔn)確將6株臨床分離株鑒定到種，而MLSA方法則直觀準(zhǔn)確的解決了這一問(wèn)題。由圖1可以看出，各臨床分離株之間雖互有差異，但仍有較高的同源性；而臨床分離株所在的分支與馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株聚類于同一簇且同源性可信度高(自展值99)，由此確認(rèn)6株臨床分離株均為馬西利亞分枝桿菌。

表4 馬西利亞分枝桿菌臨床分離株及標(biāo)準(zhǔn)株DSM 45103藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注 以上表中數(shù)據(jù)(除明確標(biāo)注外)單位均為：μg/ml；MIC：最小抑菌濃度；RGM：快速生長(zhǎng)分枝桿菌；“-”表示未找到該數(shù)據(jù)；M1、M2、M3、M4、M5、M6分別表示6株臨床分離株；DSM 45103為馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株；復(fù)方新諾明的參考界值表示抑制80%細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度；藥敏試驗(yàn)參考界值詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14-17]

在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)RGM的研究日益增多，但馬西利亞分枝桿菌的相關(guān)資料卻并不充分，這可能與馬西利亞分枝桿菌的低感染率和菌種鑒定方法滯后有關(guān)[22]。僅就本次研究而言，馬西利亞分枝桿菌感染與年齡和性別無(wú)明顯關(guān)系，而咳嗽和咯痰則是這些患者共有的臨床表現(xiàn)。

二、藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

由于NTM對(duì)常見(jiàn)的抗結(jié)核藥物的普遍耐藥和馬西利亞分枝桿菌感染患者的報(bào)道相對(duì)匱乏，臨床對(duì)馬西利亞分枝桿菌感染患者的治療仍未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)際工作中常對(duì)患者采取經(jīng)驗(yàn)性用藥控制癥狀[22-23]。為了篩選出對(duì)馬西利亞分枝桿菌感染患者有效的治療藥物，本次試驗(yàn)除按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)(M24-A2，2011)[14]方案中推薦的藥物開(kāi)展試驗(yàn)外，我們另選取了文獻(xiàn)中有較多報(bào)道用于NTM病治療的26種藥物同時(shí)開(kāi)展試驗(yàn)。在制定試驗(yàn)方法時(shí)，為更好的對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判讀，我們結(jié)合參考文獻(xiàn)[11-17]最終選定終濃度約為107CFU/ml的菌懸液開(kāi)展試驗(yàn)，并在判讀結(jié)果時(shí)使用阿爾瑪藍(lán)作為顯色劑。在本次試驗(yàn)中，馬西利亞分枝桿菌臨床分離株對(duì)力克菲蒺、頭孢哌酮、氨硫脲、氨苯砜4種藥物在最高測(cè)試濃度時(shí)仍顯示耐藥，因此判定其為高度不敏感。羅紅霉素、司帕沙星、四環(huán)素、加替沙星、頭孢美唑、阿奇霉素、紅霉素、利福噴丁 8種藥物雖未查閱到可參考的藥敏界值，但均在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)部分臨床分離株有抑制作用，特別是阿奇霉素在較低濃度范圍時(shí)即有抑制作用，可成為今后進(jìn)一步驗(yàn)證的目的藥物。馬西利亞分枝桿菌臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)株的藥物敏感度有所不同，且各臨床分離株之間對(duì)藥物的敏感度也各有差異，這可能與患者在疾病過(guò)程中的治療經(jīng)歷有關(guān)[22]。結(jié)合馬西利亞分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，馬西利亞分枝桿菌對(duì)氧氟沙星、卡那霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對(duì)氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、美羅培南、米諾環(huán)素12種藥物均耐藥，對(duì)力克菲蒺、頭孢哌酮和氨硫脲在最高試驗(yàn)濃度仍高度不敏感，以上藥物均應(yīng)在臨床治療時(shí)謹(jǐn)慎使用。

韓國(guó)學(xué)者Lyu等[24]在對(duì)比分析了26株膿腫分枝桿菌肺病患者與22例馬西利亞分枝桿菌肺病患者的治療效果后認(rèn)為：馬西利亞分枝桿菌肺病患者的療程相對(duì)較短且愈后較好；并結(jié)合體外藥敏試驗(yàn)的結(jié)果認(rèn)為一種大環(huán)內(nèi)酯類藥物(如克拉霉素)與阿米卡星、頭孢西丁等藥物的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)馬西利亞分枝桿菌肺病有較好的療效(21/22，治愈率95.5%)。我國(guó)學(xué)者聶文娟等[12]對(duì)21株馬西利亞分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)表明：阿米卡星、阿奇霉素、亞胺培南和頭孢西丁的體外抑菌活性較好。韓國(guó)學(xué)者Choi等[25]的研究則表明大環(huán)內(nèi)酯類藥物(克拉霉素和阿奇霉素)在治療馬西利亞分枝桿菌感染方面效果較好。盡管現(xiàn)階段難以確定體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療效果的相關(guān)性，但在制定NTM病的治療方案時(shí)，仍應(yīng)盡可能結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果和用藥史[8]。綜合本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果，在對(duì)確診為馬西利亞分枝桿菌感染的患者進(jìn)行治療時(shí)，可考慮一種大環(huán)內(nèi)酯類藥物(如克拉霉素或阿奇霉素)與阿米卡星、頭孢西丁等藥物的聯(lián)合應(yīng)用。

2010年我國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示：NTM在分枝桿菌分離株中占比高達(dá)22.9%[26]。在實(shí)際工作中，如何快速準(zhǔn)確的將日益增多的NTM分離株鑒定菌種仍是一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。本研究受限于樣本菌株數(shù)量較少，未能對(duì)馬西利亞分枝桿菌的流行特征和致病機(jī)制做更多分析，但MLSA方法最終成功的將基因序列相似較高的馬西利亞分枝桿菌與膿腫分枝桿菌區(qū)分鑒定，為日后開(kāi)展NTM菌種鑒定特別是基因相似度較高的“復(fù)雜”菌株的鑒定提供了新的參考和思路。

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(本文編輯：郭萌)

Species identification with multilocus sequence analysis and drug-sensitivity test inMycobacteriummassilienseclinical isolates

WEIJian-hao*,GUOQian,LIGui-lian,LIUHai-can,LIMa-chao,WUYi-mou,LOUYong-liang,LüJian-xin,WANKang-lin.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China(*NowinStateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)Correspondingauthor：WANKang-lin,Email：wankanglin@icdc.cn;LüJian-xin,Email：jxlu313@163.com

Objective To confirm the species of the clinical isolates suspectedMycobacteriummassiliense(M.massiliense) which could not be identified by the single gene comparison, and test their drug-sensitivity spectrum to provide the basis of clinical diagnosis and treatment. Methods In 2013，we collected 47 clinical samples of the patients suspected with non-tuberculous Mycobacteria (NTM) infection in Tuberculosis Laboratory of National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention. TheMycobacteriaisolates were determined with the media containing p-nitrobenzoic acid (PNB) and 2-thiophene carboxy-lic acid hydrazide (TCH) respectively and multilocus PCR. Five house-keeping genes (16S rRNA,hsp65,rpoB,sodAandrecA) were analyzed by DNA sequencing, and compared by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to identifying the species of NTM, in which the species of 6M.massilienseisolates were confirmed by means of multilocus sequence analysis (MLSA). The drug-sensitivities ofM.massilienseisolates to 36 antibiotics were tested with the minimal inhibitory concentrations (MICs) by Microplate AlamarBlue Assay(MABA). Results Of 47 clinical samples from the patients suspected with NTM infection, 34 NTM strains were isolated, in which 6 strains could not be identified by DNA sequencing and BLAST using the single gene sequence comparison with five house-keeping genes. These strains were confirmed asM.massilienseby MLSA with a Neighbor-joining tree. The drug sensitive spectrum to 36 antibiotics showed thatM.massilienseisolates were sensitive to Amikacin (16 μg/ml or 32 μg/ml), resistant to 12 kinds of anti-tuberculosis drugs, rifampin, isoniazid, ethambutol, ciprofloxacin, ethionamide, capreomycin, para-aminosalicylic acid, ofloxacin, kanamycin, cycloserine, meropenem, and minocycline; and extremely insensitive to isoniazid aminosalicylate, cefoperazone and thioacetazone. Conclusion The MLSA method is effective in identification ofM.massiliensestrain.M.massiliensestrains had a higher degree of drug resistance.

Mycobacterium； Multilocus sequence typing； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.03.016

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10003006-002-001)；傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)項(xiàng)目(2014SKLID104)

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院[魏劍浩、樓永良、呂建新、萬(wàn)康林(特聘教授)]；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[魏劍浩(研究生)、郭倩(研究生)、李桂蓮、劉海燦、李馬超、萬(wàn)康林]；南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所[郭倩、吳移謀、萬(wàn)康林(特聘教授)]；感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心[萬(wàn)康林(特聘研究人員)]

萬(wàn)康林，Email：wankanglin@icdc.cn；呂建新，Email：jxlu313@163.com

2014-12-01)