光化學(xué)法大鼠腦梗死模型的研究進(jìn)展

黃 碩,張海林,張樹泉

光化學(xué)法大鼠腦梗死模型的研究進(jìn)展

黃 碩1,張海林2,張樹泉2

在腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究中,理想的動(dòng)物模型,對(duì)于研究腦梗死的發(fā)病機(jī)制及防治措施具有重要意義。目前,用于腦梗死實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物主要有鼠、兔、狗、猴等,其中由于大鼠在心腦血管病變方面與人類較為相似,加之品系多、成本低等優(yōu)點(diǎn),成為該領(lǐng)域的主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨著研究的深入,已經(jīng)形成了多種相對(duì)成熟的腦梗死造模方法,包括線栓法、開顱電凝法、微栓子栓塞法、光化學(xué)法等。自Watson等[1]1985年通過光化學(xué)法建立腦梗死大鼠模型以來,該造模方法由于與人類腦梗死發(fā)生機(jī)制較為相似,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷小,模型穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)得到了比較廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)綜述光化學(xué)法制作大鼠腦梗死模型如下。

1 造模原理及實(shí)驗(yàn)材料的選擇

1.1 造模原理 利用光敏物質(zhì)在特定波長光作用下產(chǎn)生自由基物質(zhì),直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,使其產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物,血小板黏附于血管內(nèi)皮,激活凝血過程,形成血栓,阻塞血管導(dǎo)致缺血性腦損傷,引起炎癥及壞死。誘發(fā)血栓過程中所產(chǎn)生的血管活性物質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì)可損害血腦屏障和腦細(xì)胞,這與人類腦梗死發(fā)生極為相似[2]。

1.2 光敏劑及光源的選擇 四氯四碘熒光素,別名孟加拉玫瑰紅,英文名稱rose Bengal,分子量為1 017.6,最大吸收波長為548 nm,是迄今已知的最強(qiáng)的光敏染料。其照射光源主要有鹵素?zé)艏?46 nm濾光片、氪激光器、氙燈輻照系統(tǒng)等[3,4]。有學(xué)者報(bào)道,手持式激光器(激光筆)價(jià)格低廉,其發(fā)出的激光波長為532 nm,可作為實(shí)驗(yàn)光源[5]。赤蘚紅B,英文名稱erythrosin B,其最大吸收峰約在520 nm,大鼠最常用劑量(17～ 20)mg/kg,腹腔或靜脈注射,其最常用的光源是波長514.5 nm的氬激光光源。照射時(shí)間一般為(2～5) min。光敏Ⅱ,英文名Photofrin II,是一種包括血卟啉醚等多種成分的混合物,其最大吸收峰位于(615～ 635)nm,配合波長632 nm紅色激光照射,可產(chǎn)生含有大量紅細(xì)胞和白細(xì)胞的血小板性血栓,與人類的腦血栓形成較為相似。

2 常用的大鼠光化學(xué)法腦梗死模型

自1985年Waston等成功建立大鼠光化學(xué)法腦梗死模型以來,此模型已經(jīng)發(fā)展為4型:大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞模型、環(huán)形照射模型、大腦中動(dòng)脈阻塞模型、頸總動(dòng)脈阻塞模型。

2.1 大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞模型(Ⅰ型) 該模型是經(jīng)典的光化學(xué)法誘導(dǎo)皮質(zhì)局灶性腦缺血模型,基本步驟是:首先選定照射部位(一般選在皮質(zhì)功能區(qū)或海馬區(qū)),將充分暴露顱骨的大鼠固定在立體定位儀上,尾靜脈或腹腔注射光敏劑,用相應(yīng)光源進(jìn)行照射,部位大小可以按照需要進(jìn)行調(diào)整。該模型是早期即可出現(xiàn)血腦屏障開放、嚴(yán)重的血管源性腦水腫及微血管血栓形成,因此可用于腦梗死后微血管損傷及血腦屏障改變后的病理生理、生化及抗血小板藥物防治作用的研究。但是此種方法造成的是皮質(zhì)終末動(dòng)脈的永久性閉塞,不利于對(duì)側(cè)支循環(huán)建立及缺血再灌注損傷的研究,同時(shí)由于缺血半暗帶范圍很狹小且很快消失,亦不利于觀察缺血半暗帶的變化及相關(guān)藥物的防治作用。由于該模型自發(fā)性高血壓大鼠比正常大鼠產(chǎn)生的梗死范圍大且穩(wěn)定,因而選擇自發(fā)性高血壓大鼠造模更適合抗血栓藥物的研究[6]。

2.2 環(huán)形照射模型(Ⅱ型) 此模型的建立方法與Ⅰ型模型基本相同,但該模型照射的光源為環(huán)形光斑,使照射皮質(zhì)產(chǎn)生一個(gè)環(huán)形的缺血性損傷,中間的環(huán)形腦組織因不完全缺血產(chǎn)生一個(gè)類似半暗帶的區(qū)域[7]。該模型主要用于觀察缺血半暗帶的病理變化及評(píng)價(jià)各種腦保護(hù)防治措施的效果。由于此模型在72 h后還存在自發(fā)性的再灌注,因此也可以用于對(duì)缺血再灌注損傷及其防治的研究。

2.3 大腦中動(dòng)脈阻塞模型(即Ⅲ型) 1987年Watson等[8]首先制成光化學(xué)大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)閉塞模型,之后許多學(xué)者對(duì)該模型進(jìn)行了改進(jìn)。基本步驟是經(jīng)雄性W istar大鼠股靜脈緩慢注入12.5 mg/kg血卟啉衍生物的同時(shí),用波長630 nm 氮氖激光照射左側(cè)MCA近側(cè)段15 min,手術(shù)顯微鏡下觀察白色血栓形成。然后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)1 h開放使其再通。該方法可使MCA被照射段形成閉塞性血小板血栓,使其供血區(qū)形成較大且穩(wěn)定的梗死灶[9]。

2.4 頸總動(dòng)脈阻塞模型(Ⅳ型) 該模型是一個(gè)多發(fā)性腦梗死模型,其基本方法為暴露頸總動(dòng)脈并結(jié)扎同側(cè)頸外動(dòng)脈,注射光敏劑后將光源直射頸總動(dòng)脈,同時(shí)不斷輕微撥動(dòng)頸總動(dòng)脈,使產(chǎn)生的血栓栓子隨血流入腦從而產(chǎn)生了多發(fā)的腦梗死灶。該方法模擬了人類栓子所致腦梗死,適用于多發(fā)性腦梗死及抗血小板集聚藥物的研究。其缺點(diǎn)是所需光照強(qiáng)度和光敏劑劑量大,動(dòng)物模型長期的死亡率較高,不利于慢性腦缺血研究。

目前在四種模型中,Ⅰ型和Ⅲ型應(yīng)用較多。如謝志忠等[10]、張光運(yùn)等[11]應(yīng)用Ⅰ型模型分別研究了絞股藍(lán)總皂苷對(duì)腦缺血損傷及環(huán)磷酰胺對(duì)腦組織缺血再灌注損傷的保護(hù)作用;崔建嶺等[12]通過Ⅲ模型進(jìn)行了靜脈溶栓治療的研究,而楊文清等[13]通過該模型觀察了水蛭提取物對(duì)腦梗死的治療作用。

3 檢測指標(biāo)

3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 理想的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)既可以綜合反映神經(jīng)功能評(píng)分,又有較好的可操作性和穩(wěn)定性。目前在中風(fēng)臨床前藥物研究中,Bederson評(píng)分[14]被國內(nèi)外學(xué)者所公認(rèn),引用頻率較高,簡單介紹如下。該評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為四個(gè)功能等級(jí):A無神經(jīng)損傷癥狀為0分;B懸尾實(shí)驗(yàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分;C前肢抵抗對(duì)側(cè)推力能力下降為2分;D向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分。一些學(xué)者在應(yīng)用Bede rson評(píng)分同時(shí),對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn),如Menzies評(píng)分[15]總分為4分:A,無神經(jīng)功能損傷,雙前肢對(duì)稱向地面伸展(0分);B,對(duì)側(cè)前肢持續(xù)內(nèi)收(1分),C,對(duì)側(cè)前肢握力下降(2分);D,輕微刺激大鼠尾巴,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈(3分)或者自主持續(xù)轉(zhuǎn)圈(4分)。

3.2 腦組織水腫程度的監(jiān)測 目前評(píng)價(jià)腦組織水腫程度的方法主要是腦組織比重梯度柱測定[16]和腦組織含水量測定[17]。

3.3 腦梗死灶體積的測定 腦梗死灶的體積大小直接反映了腦缺血的嚴(yán)重程度及預(yù)后判斷。目前較為常用的方法是將梗死側(cè)的腦組織切片,經(jīng)氯化四氮唑(TTC)染色,正常組織為紅色,而梗死區(qū)為白色,采用圖像采集處理系統(tǒng)軟件測量梗死面積,計(jì)算梗死體積[18]。另外,有條件的科研機(jī)構(gòu),也可以直接行大鼠顱腦MR檢查,在MR機(jī)上測量計(jì)算梗死灶體積。

3.4 其他 除上述常用指標(biāo)外,還有一些用于研究藥物作用機(jī)制或病理生理過程的指標(biāo)。例如,凝血因子的監(jiān)測、炎性因子(TNF-α、IL-6等)的測定、血管內(nèi)皮因子及其基因表達(dá)的監(jiān)測、神經(jīng)生長因子的監(jiān)測等。

4 問題與展望

光化學(xué)法大鼠腦梗死模型較好地模擬了人類的卒中發(fā)病機(jī)制,有很大的發(fā)展前景,但在很多方面仍需進(jìn)一步完善。臨床中腦梗死患者多合并有高血壓病、糖尿病等疾病,并且這些疾病本身作為腦梗死的危險(xiǎn)因素,參與了其發(fā)病過程,因此建立合并相關(guān)疾病的光化學(xué)大鼠腦梗死模型,更能接近臨床實(shí)踐,有必要開展此類模型的研究。目前的腦梗死模型均不能完全模擬人類卒中發(fā)病機(jī)制,有自身固有的優(yōu)缺點(diǎn),因此應(yīng)根據(jù)研究目的選擇不同的腦梗死模型才能保證研究的科學(xué)性。

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R743 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.017

1672-1349(2015)05-0610-02

2014-07-29)

(本文編輯 王雅潔)

1山東中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生(濟(jì)南250000);2.泰安市中醫(yī)醫(yī)院

黃碩,E-mail:shixiaoyehs@163.com