協(xié)同刺激分子B7-H6生物學(xué)特性及其在腫瘤中的意義

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.04.009

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金海外及港澳學(xué)者合作研究基金（31428005）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81171653、30950022）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011246）；江蘇省科技條件建設(shè)與民生科技專(zhuān)項(xiàng)資金（BL2014034）

作者單位：213003 常州，蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心

通信作者：蔣敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

收稿日期：2015-06-08

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過(guò)釋放趨化因子和細(xì)胞因子，廣泛參與炎癥反應(yīng)與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在抗腫瘤、抗病毒感染以及干細(xì)胞移植等方面發(fā)揮重要作用 [1]。NK 細(xì)胞的活化取決于其細(xì)胞表面活化信號(hào)及抑制信號(hào)的共同調(diào)控。NKp30 是自然細(xì)胞毒性受體（natural cytotoxicity receptors，NCR）家族成員之一，是 NK 細(xì)胞表面重要的活化性受體，通過(guò)識(shí)別靶細(xì)胞上相關(guān)配體，介導(dǎo) NK 細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能。B7-H6是新發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子 B7 家族成員，作為 NKp30 的潛在配體，能夠激活 NKp30 介導(dǎo)的 NK 細(xì)胞活化，促使其分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞毒性 [2]。B7-H6 是 B7 家族首個(gè)被證實(shí)能夠直接誘導(dǎo) NK 細(xì)胞活化的協(xié)同刺激分子，在部分腫瘤組織中有表達(dá)，正常組織中不表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)為揭示 NKp30 在腫瘤免疫監(jiān)視中的作用提供了新的依據(jù)。

1　協(xié)同刺激分子 B7-H6 的生物學(xué)特性

Brandt 等 [3]最先研究發(fā)現(xiàn) NKp30 Fc 融合蛋白可以與K562 細(xì)胞結(jié)合，其特異性結(jié)合僅被 NKp30 單克隆抗體阻斷，而不被 NKp46 單克隆抗體阻斷。并且，NKp30 Fc 融合蛋白能夠抑制 NK 細(xì)胞對(duì) K562 細(xì)胞的結(jié)合能力與細(xì)胞毒活性。通過(guò)免疫沉淀技術(shù)對(duì) NKp30 Fc 與 K562 細(xì)胞結(jié)合后的裂解產(chǎn)物進(jìn)行沉淀并用凝膠電泳分離，質(zhì)譜分析其中的差異蛋白，最后由表面等離子金屬共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）確認(rèn)一種蛋白（DKFZp686O24166）能特異性結(jié)合 NKp30，兩者結(jié)合活性可被能阻斷 NKp30介導(dǎo)的 NK 細(xì)胞活化的 NKp30 單克隆抗體所抑制。由于該蛋白基因和蛋白結(jié)構(gòu)與 B7 家族其他成員類(lèi)似，并且其受體 NKp30 與 CD28 家族相關(guān)，因此被命名為 B7-H6分子。

B7-H6 基因定位于染色體 11p15.1，在人類(lèi) dbEST 數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有 4 種 cDNA 的表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）。B7-H6 與 B7 家族成員中 B7-H1、B7-H3 同源性最高，其開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)分子量為 51 kD 的免疫球蛋白超家族 I 型跨膜糖蛋白。B7-H6 胞外區(qū)含有兩個(gè)由外顯子編碼的 Ig 結(jié)構(gòu)域，包含 6 個(gè)重要的 N 連接糖基化位點(diǎn)。B7-H6 胞內(nèi)區(qū)域與 GAG 多聚蛋白同源性較高，含有多種信號(hào)基序，例如免疫受體酪氨酸依賴(lài)抑制基序、Src同源性 2 結(jié)合基序等，這種特性提示 B7-H6 可通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)蛋白的交互作用誘導(dǎo) NK 細(xì)胞表面受體活化 [3]。

2　協(xié)同刺激分子 B7-H6 的表達(dá)情況

小鼠基因的 B7-H6 相關(guān)序列僅與人類(lèi)基因第一外顯子相對(duì)應(yīng)，因此 B7-H6 在小鼠基因中表達(dá)缺失 [4]。B7-H6 mRNA 在絕大部分人類(lèi)正常組織中不表達(dá)，這一結(jié)果與其基因微陣列檢測(cè)結(jié)果一致。用親和純化的 B7-H6 抗血清或 B7-H6 單克隆抗體在新鮮分離的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中未檢測(cè)到B7-H6 的表達(dá)。此外，在植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激后的 PBMC 中也未觀(guān)察到 B7-H6 的表達(dá)。值得注意的是，盡管 NKp30 受體在 NK 細(xì)胞和 DC 細(xì)胞的交互調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，但是在經(jīng) IL-4、GM-CSF刺激誘導(dǎo)而來(lái)的靜止或活化的 DC 細(xì)胞中也未檢測(cè)到B7-H6 [5]。B7-H6 mRNA 主要表達(dá)于不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系，包括淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、惡性上皮腫瘤以及其他原發(fā)性腫瘤等。在多種血液系統(tǒng)腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞中也有 B7-H6 的表達(dá)。B7-H6 局限于腫瘤組織中表達(dá)與 NK細(xì)胞在壓力誘導(dǎo)模式下啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)的機(jī)制吻合 [6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，B7-H6 除了在腫瘤組織表達(dá)外，其基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)可在 Toll 樣受體激動(dòng)劑以及促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 的誘導(dǎo)下于活化的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上表達(dá)。這一研究揭示，B7-H6 不僅對(duì)腫瘤免疫監(jiān)視有影響，還能在感染條件下參與機(jī)體炎癥反應(yīng) [7]。

3　協(xié)同刺激分子 B7-H6 與其受體 NKp30 的作用通路及調(diào)控機(jī)制

B7-H6 特異性地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并能被 NKp30識(shí)別、誘導(dǎo) NK 細(xì)胞活化。NKp30 基因定位于染色體6p21.32，分子量為 30 kD，與 CTLA-4 有 25% 的同源性，屬于免疫球蛋白超家族成員，胞外僅含有一個(gè) IgV 樣區(qū)域，跨膜區(qū)有一個(gè)帶正電荷的精氨酸殘基，通過(guò)電荷作用與CD3ζ 鏈結(jié)合從而傳遞活化信號(hào) [8]。NKp30 主要表達(dá)在人靜止或活化的 NK 細(xì)胞表面，但最近也有研究表明，在 IL-15刺激后的臍帶血 T 細(xì)胞以及黃體酮干預(yù)后的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中也有 NKp30 表達(dá) [9-10]。作為 NK 細(xì)胞重要的活化性受體，NKp30 與 NKG2D、DNAM-1 等其他受體相同，可以識(shí)別多種配體，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng) [11]。目前已知熱休克因子釋放的核蛋白 HLA-B 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 3 和人巨細(xì)胞病毒 pp56 蛋白能夠結(jié)合 NKp30，但兩者均不在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。B7-H6 不被 NK 細(xì)胞表面 NKp44、NKp46 以及 NKG2D 等活化性受體識(shí)別，NKp30 也不與 B7-H1、B7-DC、B7-H3 等 B7 家族成員結(jié)合，表明 NKp30 胞外區(qū)域能與 B7-H6 胞外區(qū)直接并特異性結(jié)合。NKp30 通過(guò)與 B7-H6IgV 結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成的復(fù)合物主要依賴(lài) NKp30 中 11 個(gè)氨基酸殘基與 B7-H6 中 12 個(gè)氨基酸殘基間的疏水作用力，并且 B7-H6 分子 125 ~ 130 位氨基酸形成的loop 環(huán)在與 NKp30 結(jié)合中發(fā)揮重要作用 [12]。

B7-H6/NKp30 途徑主要通過(guò)誘導(dǎo) NK 細(xì)胞活化、促進(jìn)其分泌 IL-2 和 IFN-γ 等細(xì)胞因子，增強(qiáng) NK 細(xì)胞殺傷能力，參與抗腫瘤免疫反應(yīng)。Schlecker 等 [13]發(fā)現(xiàn)整合素金屬蛋白酶 10（adisintegrin and metalloprotease 10，ADAM 10）可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞外 B7-H6 分子的脫落，阻礙 NK 細(xì)胞通過(guò) NKp30 受體途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，通過(guò)抑制ADAM 10 的活性，能夠提高腫瘤細(xì)胞 B7-H6 的表達(dá)，增強(qiáng) NKp30 介導(dǎo)的 NK 細(xì)胞活化能力。因此，B7-H6/NKp30途徑對(duì)阻止腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視發(fā)揮重要作用。

B7-H6 的表達(dá)主要與組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）的調(diào)節(jié)有關(guān)。Fiegler 等 [2]證實(shí) I 型組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）可以下調(diào) B7-H6 mRNA 在多種腫瘤細(xì)胞系上的表達(dá)，同時(shí) I 型 HDACi 在轉(zhuǎn)染小干擾 RNA（siRNA）后，B7-H6 基因表達(dá)沉默，從而影響 NK 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力。這些研究表明抑制 B7-H6 表達(dá)主要與減少其報(bào)告基因活性以及降低啟動(dòng)子乙?；接嘘P(guān)。這一研究結(jié)果與之前報(bào)道的 HDACi 通過(guò)增強(qiáng) NK 細(xì)胞活化受體 NKG2D相關(guān)配體的表達(dá)水平，從而提高 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)截然相反。由此可見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞表面不同配體的表達(dá)對(duì) HDACi 聯(lián)合 NK 細(xì)胞腫瘤免疫治療的臨床轉(zhuǎn)歸有深遠(yuǎn)影響。

4　協(xié)同刺激分子B7-H6在腫瘤治療中的意義

B7-H6 主要表達(dá)在造血系統(tǒng)或非造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系表面，但對(duì)于其在腫瘤組織中的表達(dá)情況研究還不夠深入。到目前為止，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法已在胃癌及非小細(xì)胞肺癌等人類(lèi)腫瘤組織中檢測(cè)到 B7-H6 蛋白的表達(dá)。

Chen 等 [14]檢測(cè)到 B7-H6 在原發(fā)性胃癌中有表達(dá)，雖然 B7-H6 在原發(fā)性胃癌中的表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后沒(méi)有相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn) B7-H6 的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的分化程度相關(guān)，細(xì)胞分化程度越高，B7-H6 蛋白表達(dá)水平也越高。Zhang 等 [15]在非小細(xì)胞肺癌中檢測(cè)到了 B7-H6 的表達(dá)，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了 B7-H6 受體 NKp30 在組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，B7-H6 在腫瘤組織及鄰近非腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且 B7-H6 表達(dá)與除細(xì)胞分化水平外的其他臨床病理特征無(wú)相關(guān)性，B7-H6 的受體NKp30 在腫瘤組織及鄰近非腫瘤組織中表達(dá)也無(wú)顯著差異，這一結(jié)論與 Chen 等在胃癌中的研究結(jié)果相似。有關(guān)B7-H6 蛋白在其他腫瘤組織中的表達(dá)有待于研究。

NK 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別模式之一為“壓力誘導(dǎo)”模式（stress-induced mode），是指靶細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化、病毒感染、炎性反應(yīng)或化學(xué)刺激等壓力作用下，靶細(xì)胞自身蛋白可在轉(zhuǎn)錄因子 HSF 的調(diào)控下上調(diào)表達(dá)，從而被 NK 細(xì)胞活化受體識(shí)別，激活 NK 細(xì)胞，發(fā)揮殺傷功能。Kellner 等 [16]首先制備出一種包含 B7-H6 分子胞外結(jié)構(gòu)域以及 CD20 抗體單鏈可變區(qū)段 7D8 的重組融合蛋白，該蛋白可以與 CD20 +的淋巴瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，使細(xì)胞高表達(dá) B7-H6 分子，并通過(guò) B7-H6/NKp30 途徑使 NK 細(xì)胞活化并釋放顆粒酶、穿孔素溶解靶細(xì)胞。

B7-H6 除了在 NK 細(xì)胞的活化及生物學(xué)功能的發(fā)揮中有重要作用，還可以通過(guò)基因修飾等途徑參與 T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。Zhang 等 [17]報(bào)道，利用基因工程技術(shù)，將以非 MHC 限制性方式識(shí)別目標(biāo)抗原（B7-H6）的嵌合受體（NKp30）通過(guò)激活信號(hào)，以病毒載體或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)方式轉(zhuǎn)染 T 細(xì)胞，由此制備出的 NKp30-CAR-T 細(xì)胞可以不依賴(lài)于 MHC 限制性，特異性識(shí)別 B7-H6 +的腫瘤細(xì)胞，分泌 IFN-γ 并殺傷腫瘤細(xì)胞。研究者將這種胞內(nèi)含有CD28 信號(hào)區(qū)的 NKp30-CAR-T 細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給 B7-H6 +的淋巴瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。這一研究成果為過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的臨床應(yīng)用提供了新的思路。

5　展望

B7-H6/NKp30 途徑的發(fā)現(xiàn)揭示了 NK 細(xì)胞活化的一種嶄新的分子機(jī)制。B7-H6 局限在腫瘤組織中表達(dá)也是機(jī)體在應(yīng)激壓力下誘導(dǎo)自身蛋白表達(dá)的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)。目前，對(duì)B7-H6 的作用機(jī)制尚未明確，在腫瘤患者的縱向研究中，需要探究 B7-H6 在腫瘤組織中的表達(dá)不受腫瘤免疫編輯的影響而發(fā)生變化，以及 B7-H6 與其受體 NKp30 如何與腫瘤微環(huán)境中其他信號(hào)分子共同形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化與功能。如果明確 B7-H6 能特異性并穩(wěn)定地在腫瘤組織中表達(dá)，提示將 B7-H6/NKp30 作為腫瘤免疫治療新靶標(biāo)有廣闊前景，也為腫瘤的臨床綜合診療提供了新的策略。