心肌缺血－再灌注—鈣超載損傷的基礎(chǔ)與臨床研究

孔令恒，劉 哲，張建英，周京軍

心肌缺血－再灌注—鈣超載損傷的基礎(chǔ)與臨床研究

孔令恒，劉 哲，張建英，周京軍

［關(guān)鍵詞］：心?。烩}；缺血－再灌注；線粒體

作者單位：西安，710032第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室［孔令恒、劉 哲（2013級五年制臨床醫(yī)學(xué)本科學(xué)員）、張建英、周京軍］；710021西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所（孔令恒）

心肌缺血－再灌注損傷（ischemic－reperfusion in?jury，IRI）是急性心肌梗死溶栓治療、冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、心臟停跳手術(shù)過程中不可避免的伴隨事件，可導(dǎo)致心肌頓抑、心肌梗死、心律失常，甚至因心衰致死。研究證實(shí)，心肌缺血－再灌注過程中存在Ca2＋水平的非生理性顯著升高，即鈣超載，它是造成心肌損傷的重要原因，這為心肌保護(hù)提供了思路；同時(shí)也指出，闡明鈣超載的發(fā)生機(jī)制和損傷機(jī)理是后續(xù)工作的重要方向。

1 胞漿鈣超載與心肌損傷

1．1 胞漿鈉超載和鈣超載的機(jī)制分析 缺血所致的心肌胞內(nèi)鈉超載是多因素作用的結(jié)果［1］，主要包括：①細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低，使得鈉泵活動(dòng)減弱；②糖酵解活動(dòng)加強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)酸中毒逐漸加劇，這將激活鈉－氫交換體（Na＋／H＋exchanger，NHE）和鈉－碳酸氫根離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na＋－HCO－3cotransport? er）；③膜電位降低，晚鈉電流（late sodium current）增大。另一方面，缺血也造成胞內(nèi)鈣超載，主要原因有：①隨著胞內(nèi)ATP的降低，肌漿網(wǎng)鈣泵的活動(dòng)減弱；②膜電位的去極化和細(xì)胞內(nèi)外Na＋濃度梯度的降低使得肌膜鈉－鈣交換體（Na＋／Ca2＋exchanger，NCX）處于Ca2＋內(nèi)流模式；③有研究認(rèn)為，缺血可使心肌膜電位去極化，L－型鈣通道開放，Ca2＋內(nèi)流。

缺血后再灌注早期，隨著細(xì)胞外H＋的流失，NHE活動(dòng)加強(qiáng)，與此同時(shí)，鈉泵功能尚未恢復(fù)，這些因素的共同作用使得胞內(nèi)鈉超載仍將持續(xù)；胞內(nèi)鈉超載造成鈉－鈣交換體依舊處于Ca2＋內(nèi)流模式，造成舒張期Ca2＋水平持續(xù)升高［1］；另外，在ATP水平逐漸恢復(fù)的過程中，肌漿網(wǎng)鈣泵將不斷攝取Ca2＋，同時(shí)雷諾丁受體（ryanodine receptor，RyR）發(fā)生Ca2＋漏，會(huì)產(chǎn)生異常性鈣振蕩。直至線粒體、肌漿網(wǎng)、鈉泵等功能恢復(fù)，鈣穩(wěn)態(tài)才趨于正常。

根據(jù)以上理論，以改善胞內(nèi)鈉超載和鈣超載為思路的心肌保護(hù)藥物應(yīng)運(yùn)而生［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制NHE活性可顯著減輕IRI。然而臨床研究存在爭議，一方面，項(xiàng)目名為“GUARDIAN”和“ESCAMI”的多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)，其抑制劑卡立泊來德和依尼泊胺并未明顯降低缺血性心臟病患者治療后的死亡率或縮小梗死面積；另一方面，名為“EXPEDI?TIOIN”的臨床研究發(fā)現(xiàn)NHE抑制劑對冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者有一定的保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，MCC－135兼具抑制肌漿網(wǎng)鈣漏和NCX介導(dǎo)的Ca2＋內(nèi)流作用，然而臨床研究并未獲得滿意效果。KBR7943和SN－6是阻斷NCX的Ca2＋內(nèi)流模式的常用工具藥，但是，它們能否作為臨床藥物還不得而知。

1．2 胞內(nèi)鈣超載的損傷機(jī)制

1．2．1 心肌攣縮 攣縮是心肌在缺血－再灌注過程中產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，是臨床“石頭心”產(chǎn)生的重要原因。光鏡和電鏡下可見，線狀的肌絲被擠壓成團(tuán)塊，形成致密的“收縮帶”；記錄室內(nèi)壓時(shí)可觀察到舒張期左室壓力不能下降至正常水平（5～10 mm Hg）。攣縮一方面引起心肌舒張功能障礙，由此使得舒張末期心室充盈血量減少，最終造成循環(huán)衰竭；另一方面，攣縮產(chǎn)生的物理性張力可破壞閏盤的結(jié)構(gòu)與功能，致細(xì)胞間通訊障礙，嚴(yán)重時(shí)將撕裂細(xì)胞膜，致細(xì)胞間隙增大，肌紅蛋白等大量的細(xì)胞內(nèi)容物漏出，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生收縮帶性壞死。

缺血與再灌注期心肌均可發(fā)生攣縮。缺血可致心臟出現(xiàn)一種“僵直性攣縮”，即隨著缺血時(shí)間的延長，左室舒張期壓力持續(xù)上升。在缺血后再灌注早期，心臟會(huì)出現(xiàn)“頻發(fā)性攣縮”，表現(xiàn)為一種高頻率、不依賴竇房結(jié)的自發(fā)性心肌收縮［1］。此時(shí)，舒張期室內(nèi)壓的變化與損傷程度密切相關(guān)，如損傷較輕，室內(nèi)壓將在一段時(shí)間內(nèi)逐漸恢復(fù)至正常；若損傷較重，舒張期室內(nèi)壓將持續(xù)維持在較高水平。

目前認(rèn)為，ATP耗盡是僵直性攣縮的重要原因，而胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致頻發(fā)性攣縮的元兇。在缺血期，ATP逐漸耗盡，這將造成結(jié)合于肌球蛋白的ADP不能被ATP置換，最終使得肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的解離發(fā)生障礙，肌絲處于收縮僵直狀態(tài)。在缺血后再灌注早期，缺血期形成的胞內(nèi)鈉超載將激活NCX，同時(shí)肌漿網(wǎng)鈣釋放通道也出現(xiàn)“鈣漏”，兩者共同引發(fā)自發(fā)性鈣振蕩，高負(fù)荷鈣與肌鈣蛋白的頻發(fā)結(jié)合與解離最終導(dǎo)致心臟發(fā)生頻發(fā)性攣縮［1］。

通過干預(yù)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，以減輕攣縮，達(dá)到心肌保護(hù)作用的這一方法的有效性已得到驗(yàn)證。2，3－丁二酮一肟（2，3－butanedione mon?oxime，BDM）是首個(gè)成功研發(fā)的抗攣縮工具藥，是移植心臟的保護(hù)劑。藥理學(xué)研究觀察到，BDM可使去膜心肌纖維張力－PCa曲線右移，顯著抑制橫橋ATP酶的活性，降低ATP的利用率。然而，由于BDM具有促肌漿網(wǎng)“鈣漏”的非特異性作用，其應(yīng)用受到一定限制。Blebbistatin作為一種非經(jīng)典肌球蛋白橫橋ATP酶的抑制劑，被用于探討非肌細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生命現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制；近年研究發(fā)現(xiàn)，Blebbistatin也顯著抑制肌細(xì)胞橫橋ATP酶的活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）約為2 mM，這為研究影響心肌攣縮的因素提供了新的手段。

1．2．2 鈣蛋白酶 鈣蛋白酶也稱Ca2＋依賴的非溶酶體類中性半胱氨酸蛋白酶［2］。該家族存在14個(gè)亞型（命名為鈣蛋白酶1～14），1個(gè)調(diào)節(jié)亞單位和1個(gè)內(nèi)源性抑制分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，各亞型包含I～I(xiàn)V四個(gè)重要結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域I的特征還不十分清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶－1，2和9的結(jié)構(gòu)域I可發(fā)生Ca2＋依賴性自水解，認(rèn)為是酶活化的重要步驟；結(jié)構(gòu)域II是酶的活性中心，其中半胱氨酸、天冬酰胺和組氨酸形成高度保守的催化三聯(lián)體，結(jié)構(gòu)域II還可結(jié)合2個(gè)Ca2＋，有助于酶的活化；結(jié)構(gòu)域III含有2個(gè)Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)磷脂結(jié)合位點(diǎn)，參與酶活性的調(diào)節(jié)和對底物的識(shí)別；結(jié)構(gòu)域IV含有5個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)，可結(jié)合Ca2＋、內(nèi)源性抑制分子和調(diào)節(jié)亞單位，是鈣蛋白酶的重要分子結(jié)構(gòu)特征。需要說明的是，亞型－1和2可分別與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合，組成典型的m－和m－鈣蛋白酶，它們是心肌的主要表達(dá)形式。

( ) 1.When I returned to my hometown, I was nearly lost. Almost_______ had changed.

鈣蛋白酶與心肌IRI的關(guān)系已被廣泛研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著IRI程度的加重，胞內(nèi)鈣超載引發(fā)鈣蛋白酶發(fā)生肌膜轉(zhuǎn)位的數(shù)量將明顯增加，再灌注期鈣蛋白酶的活性顯著增強(qiáng)。鈣蛋白酶可水解細(xì)胞骨架蛋白-胞襯蛋白，功能蛋白如肌膜鈉泵、肌漿網(wǎng)鈣泵，還可水解、活化線粒體凋亡相關(guān)分子bid，最終導(dǎo)致肌膜破裂，線粒體功能紊亂，心功能障礙和細(xì)胞死亡［3］。MDL－28170是研究鈣蛋白酶功能的常用工具藥，通過與三聯(lián)體結(jié)構(gòu)中的巰基結(jié)合而抑制酶的活性。筆者和他人的工作均表明，MDL－28170可顯著減輕急性鈣超載性心肌損傷［4］。因此，鈣蛋白酶有望成為臨床治療IRI的又一靶點(diǎn)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶增加蛋白質(zhì)的泛素化，介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解；在高表達(dá)內(nèi)源性抑制分子的小鼠，心肌出現(xiàn)蛋白質(zhì)異常聚集。因此，鈣蛋白酶對心肌蛋白質(zhì)的更新作用不容忽視，鈣蛋白酶抑制劑的臨床應(yīng)用可行性尚需做全面評價(jià)。

1．2．3 鈣／鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）依賴的II型蛋白激酶（calcium－calmodulin－dependent protein ki?nase II，CaMKII） CaMKII屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，包含由4個(gè)基因編碼的a、b、g和d四種單體，每一單體包含氨基端催化域、中間調(diào)節(jié)域和羧基端結(jié)合域。羧基端結(jié)合域是同源或異源結(jié)合區(qū)，12個(gè)單體聚合形成全酶。調(diào)節(jié)域又可分為假底物區(qū)和鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)。鈣調(diào)蛋白是由約150個(gè)氨基酸組成的高度保守的多肽，呈啞鈴狀的空間結(jié)構(gòu)，中間為細(xì)長的a－螺旋結(jié)構(gòu)，兩端各有2個(gè)Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)。Ca2＋／CaM與調(diào)節(jié)域的結(jié)合將解除假底物區(qū)和催化域的相互作用，自身抑制作用消失，酶被活化；而且，CaMKII的活化可使得假底物區(qū)的Thr286／287（在b、g和d單體中為T287，在a單體中為T286）發(fā)生自動(dòng)磷酸化，自此CaMKII的活化將不再依賴Ca2＋／CaM。研究還發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可使假底物區(qū)的Met281／282被氧化（ox－CaMKII），進(jìn)而激活CaMKII。

哺乳動(dòng)物心臟主要表達(dá)d亞基，根據(jù)不同剪接形式，又分為CaMKII dB和CaMKII dC。CaMKII可磷酸化L－型鈣通道、肌漿網(wǎng)鈣釋放通道與鈣泵，通過精確調(diào)控興奮－收縮偶聯(lián)過程中鈣的周期性變化，完成頻率依賴性舒張功能增強(qiáng)等生理現(xiàn)象的調(diào)節(jié)。CaMKII還可磷酸化鈉通道與鉀通道蛋白，提示CaMKII可作為鈣負(fù)反饋調(diào)節(jié)的介質(zhì)，改變興奮－收縮偶聯(lián)過程中心肌的興奮性。

KN－62、KN－93和AIP是研究CaMKII功能的常用工具藥。KN－62和KN－93可與CaM競爭性結(jié)合CaMKII的結(jié)合區(qū)，進(jìn)而抑制CaMKII的活性；AIP則與底物競爭性占據(jù)CaMKII的底物結(jié)合區(qū)，抑制CaMKII對底物的磷酸化。實(shí)驗(yàn)觀察到，缺血－再灌注激活CaMKII，抑制劑KN－93和AIP可顯著減輕線粒體損傷，減少心肌死亡，表明CaMKII是防治心肌缺血－再灌注損傷的靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究提示，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF－kB炎癥信號(hào)通路，破壞細(xì)胞膜的完整性是應(yīng)激條件下CaMKII致心肌損傷的重要機(jī)制［5］。線粒體或許也是CaMKII的作用靶點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，CaMKII增加線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體承載的鈣電流，加速膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，引起心肌損傷［6］；然而，這一現(xiàn)象并未得到其它研究組的肯定［7］。

2 線粒體鈣超載與心肌損傷

2．1 線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的維持 早期的電鏡結(jié)果表明，缺血－再灌注的心肌線粒體發(fā)生腫脹、出現(xiàn)大量的致密性沉積顆粒；生化分析證實(shí)，沉積顆粒的主要成分是Ca2＋和磷酸鹽，提示，線粒體鈣超載是心肌損傷的重要原因。

線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的維持依賴于電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）、鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（mitochondria Ca2＋uniporter）、NCX等分子［8］。VDAC位于線粒體外膜，含VDAC1、VDAC2 和VDAC3三種亞型，蛋白分子量約30 kDa，有1個(gè)a螺旋和13個(gè)b片層跨膜區(qū)。VDAC不僅對K＋、Cl－、腺嘌呤核苷酸、磷酸鹽等分子有通透性，也是Ca2＋進(jìn)入線粒體的首要閘門。鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體位于內(nèi)膜，電導(dǎo)低，對Ca2＋有高度選擇性，可被釕紅選擇性阻斷。Rizzuto從MitoCarta數(shù)據(jù)庫中找到了對應(yīng)的編碼基因，蛋白質(zhì)分子量為40 kDa，含兩次跨膜結(jié)構(gòu)域，有“孔道”組份。進(jìn)一步研究表明，完整的鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體是多分子組成的復(fù)合體，已知的成分包括職掌“傳感器”作用的轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)蛋白－1 （uniporter regulator 1，MCU1），轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)蛋白－2和肩負(fù)“連接”作用的必要調(diào)節(jié)蛋白（essential MCU regulator，EMRE）［9］。線粒體外排Ca2＋主要依賴NCX，它不同于肌膜NCX，具有鋰／鈣交換的能力，其活性可被CGP－37157選擇性抑制，因此也稱為鈉／鋰／鈣交換（Na／Li／Ca exchanger，NCLX）。此外，研究發(fā)現(xiàn)，線粒體還存在不依賴鈉的鈣外排方式，由氫／鈣交換體完成，化學(xué)計(jì)量法得出，1個(gè)Ca2＋可能交換2或3個(gè)H＋。

Ca2＋、肌漿網(wǎng)（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）與線粒體間存在著復(fù)雜的相互聯(lián)系［8］。采用熒光和電鏡技術(shù)可觀察到存在于肌原纖維間的線粒體與部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相偶聯(lián)。分離、純化能獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互作用的膜組分（mitochondria－associated membrane，MAM）。研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)－線粒體偶聯(lián)，如線粒體融合蛋白－2（mitofusin－2）與自身或線粒體融合蛋白－1的相互作用，具有分子伴侶作用的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白－75（glucose－regulated protein 75，GRP75）與VDAC和1，4，5三磷酸肌醇受體的相互綁定。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)–線粒體偶聯(lián)部位能形成微區(qū)Ca2＋信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器間的信息交流。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅影響線粒體功能，如激活丙酮酸脫氫酶、a－酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶，促進(jìn)能量合成，或改變細(xì)胞命運(yùn)，引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死；線粒體也作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與對鈣釋放通道的調(diào)控。

采用Ca2＋成像技術(shù)觀察到，缺血期胞漿Ca2＋水平直接影響線粒體鈣超載程度，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體可能是這一事件的元兇。研究還發(fā)現(xiàn)，采用胡蘿卜素和雷諾丁減少肌漿網(wǎng)的Ca2＋回?cái)z與釋放可明顯減弱線粒體鈣超載；用秋水仙素干預(yù)微管系統(tǒng)，解除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)–線粒體的偶聯(lián)關(guān)系，也同樣阻抑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促線粒體的鈣超載效應(yīng)［10］。提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)–線粒體偶聯(lián)異?；蛟S是再灌注心肌線粒體鈣超載、細(xì)胞死亡的關(guān)鍵原因。其它線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)分子在IRI中的作用有待進(jìn)一步研究。

2．2 膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）與線粒體鈣超載所致心肌損傷 目前認(rèn)為，線粒體mPTP是由腺苷酸移位酶、親環(huán)素D、磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)體等分子組成的復(fù)合體［11］。它是缺血－再灌注等應(yīng)激因素作用的產(chǎn)物，是一類非選擇性通道，允許離子、水和分子量小于1．5 KDa的物質(zhì)在胞漿和線粒體基質(zhì)間自由交換。大量研究表明，mPTP的形成是線粒體膜電位降低、線粒體腫脹與完整性喪失的關(guān)鍵因素。它將導(dǎo)致ATP耗竭，促凋亡因子釋放，最終細(xì)胞壞死和凋亡。環(huán)孢菌素是mPTP形成的抑制物，臨床小樣本統(tǒng)計(jì)資料也證實(shí)，再灌注期給予環(huán)孢菌素可顯著減輕心肌損傷［12］。那么，線粒體鈣超載引起的細(xì)胞死亡是否依賴于mPTP的開放？追溯mPTP的研究歷程發(fā)現(xiàn)，這一概念起源于線粒體的Ca2＋研究。實(shí)驗(yàn)觀察到，將Ca2＋加入至提取的線粒體懸液后，可引起線粒體內(nèi)膜的通透性增大，線粒體腫脹。后續(xù)的工作發(fā)現(xiàn)，親環(huán)素D缺失的細(xì)胞可耐受鈣超載，提示親環(huán)素D是Ca2＋的直接作用分子。然而，令人值得思考的問題是心肌細(xì)胞發(fā)生一次興奮后，胞漿Ca2＋水平可以達(dá)到使離體線粒體mPTP開放的程度，但為何這一現(xiàn)象沒有發(fā)生？此外，在細(xì)胞水平將靜息胞漿Ca2＋由100 nM提升至1 mM，也不能易化mPTP的開放。因此，Ca2＋與mPTP的關(guān)系還需深入探討。

3 展望

減輕鈣超載，保護(hù)缺血－再灌注心肌的思路掀起了以鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體和鈣依賴蛋白為干預(yù)靶點(diǎn)的藥物研發(fā)熱潮，然而臨床療效不滿意、可選擇的藥物少等問題給研究工作帶來了新的挑戰(zhàn)。由于基礎(chǔ)疾病如糖尿病的存在，性別、年齡等因素的影響，不同鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體在鈣超載中的角色有待明確，是否還存在新的分子也需闡明。在鈣超載致心肌損傷的分子機(jī)制研究中，不同鈣依賴蛋白間的相互關(guān)系亟需明確，哪一分子發(fā)揮主導(dǎo)作用有待論證，藥理學(xué)研究亟待加強(qiáng)。相信，隨著對鈣超載研究的深入，必將為心肌缺血－再灌注損傷的防治提供新手段。

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修訂日期：（2015?08?10）

收稿日期：（2015?07?22）

通訊作者：周京軍，Email：jjzhou＠fmmu．edu．cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371181）