腦出血后死亡神經(jīng)元標記方法的研究進展

靳 航，郭珍妮綜述，吳 江，邢英琦，楊 弋審校

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是腦卒中的一種亞型，其病死率和致殘率均很高。到目前為止，人們對于腦出血的損傷機制知之甚少，而治療方法更是乏善可陳。腦出血的研究大多是通過基礎(chǔ)實驗來進行，實驗性腦出血模型的選擇和建立對于研究腦出血的病理生理學過程和藥物療效方面至關(guān)重要，目前廣泛應用于動物實驗的兩個腦出血模型為基底節(jié)自體血或膠原酶注射。選擇基底節(jié)注射的原因是基底節(jié)(包括殼核，尾狀核和丘腦)是ICH 最常見的部位［1］。以往的實驗性腦出血研究中發(fā)現(xiàn)，腦組織中的血腫致使腦水腫的生成和神經(jīng)元損傷。在血腫周邊可以看到大量的細胞死亡，血腫導致神經(jīng)細胞死亡的原因有:(1)血腫形成過程中對周邊腦組織的機械壓迫作用［1］;(2)血腫內(nèi)紅細胞裂解釋放出的毒性成分，如鐵離子和凝血酶，也是導致繼發(fā)性腦損傷的重要原因［2］。腦出血后神經(jīng)元死亡以壞死為主;另有研究表明出血后灶周組織細胞核內(nèi)存在與NF-κB 表達相關(guān)的凋亡［3，4］;最近更有研究顯示，自噬作為另一種程序性死亡方式，也存在于腦出血后灶周組織細胞內(nèi)，成為腦出血后神經(jīng)元死亡的第三種方式［5，6］。尋找能夠準確反映血腫灶周細胞損傷和死亡的標志物對于實驗性腦出血損傷機制的研究和治療方法的評估至關(guān)重要。

目前有一些方法能夠?qū)ρ[周邊損傷腦組織進行描述，如一些常規(guī)的染色方法包括神經(jīng)元核抗原染色，能夠依據(jù)神經(jīng)元細胞缺失來明確細胞變性死亡，但上述染色方法對變性細胞和正常形態(tài)細胞差異并不顯著，很容易出現(xiàn)假陽性或假陰性［7］;還有一些新興的用于特異性檢測神經(jīng)元損傷的染色方法，包括TUNEL 染色，用于明確DNA 損傷［8］;Fluoro-Jade染色，用于檢測死亡神經(jīng)元［9］;體內(nèi)注射碘化丙啶(PI)，用于標記細胞膜受損的細胞，是一種活體示蹤劑［10］，已應用于腦出血后灶周組織損傷的衡量。盡管這幾種方法對于顯示血腫灶周損傷均有很高的敏感性，但很難劃定腦出血后血腫周圍組織的損傷范圍;近年來有報道，DARPP-32 是基底節(jié)GABA 能神經(jīng)元的特異性標志物［11］，已有相關(guān)文獻報道其能夠準確標記出神經(jīng)元受累的區(qū)域，對于實驗性腦出血早期所致的基底節(jié)腦損傷的量化對于疾病的機制研究和治療的評估均有重要的價值［12］。本文將就這些標記方法進行綜述，并綜合分析其優(yōu)缺點，以期為實驗性腦出血的研究工作提供幫助。

1 神經(jīng)元核抗原(neuron-specific nuclear protein，NeuN)染色

Mullen 等于1992 年首次報道這種神經(jīng)細胞標志蛋白［13］。NeuN 是一種可溶性核蛋白，表達在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)多數(shù)神經(jīng)細胞中的特異性蛋白，在體外能夠與成熟的神經(jīng)元細胞核內(nèi)DNA 結(jié)合，因此成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)元的標志物，被廣泛應用于動物實驗免疫組織化學染色中。NeuN 在免疫印跡分析中顯示出3 個條帶，分子量介于46～48 kD。在大鼠中，NeuN 陽性神經(jīng)元廣泛分布于大腦皮質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、脊髓后角。其中，以皮質(zhì)神經(jīng)元的NeuN 免疫活性最強，而在小腦浦肯野細胞和嗅球則表達缺失。NeuN 在病理狀態(tài)下腦內(nèi)神經(jīng)元中的免疫活性大幅下降，因此能夠明確神經(jīng)元缺失、死亡情況［14，15］。在腦出血的相關(guān)研究中，Zhao 等利用實驗性SD 大鼠自體血注射模型在出血1 d、3 d 和7 d 后進行腦組織冰凍切片NeuN 免疫組織化學染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在出血不同時間點，皆能在血腫灶周組織中發(fā)現(xiàn)NeuN 免疫缺失區(qū)域，即細胞死亡，選點計數(shù)NeuN陽性細胞即可定量分析腦出血灶周細胞死亡嚴重程度。該研究還通過計數(shù)NeuN 陽性細胞來評價鐵螯合劑治療腦出血的療效，清晰明了［16］。但有學者認為NeuN 陰性不僅見于神經(jīng)元缺失，還見于蛋白免疫原性缺失［17］。此外，NeuN 主要針對皮質(zhì)神經(jīng)元，而對基底節(jié)損傷細胞的顯示欠佳，而大多數(shù)在體腦出血基礎(chǔ)研究所選用的病變部位為基底節(jié)(高血壓性腦出血的好發(fā)部位)，因此NeuN 作為腦出血灶周神經(jīng)元死亡標記物的價值仍值得商榷。

2 Fluoro-Jade C(FJC)染色

目前用于變性神經(jīng)元染色的FJ 染料分別有FJ、FJB 和FJC 三種，均由Schmued 及其團隊分別在1997 年［18］，2000年［19］和2005 年［20］報道。FJB 和FJC 均為FJ 衍生而出。FJ是一種三價陰離子熒光素衍生物，分子量為445D。FJ 的發(fā)射峰為550 nm，激發(fā)峰值分別在362 nm 和390 nm。FJ 染料對變性神經(jīng)元具有很高親和力，在紫外線照射下，變性神經(jīng)元呈現(xiàn)綠色熒光。與傳統(tǒng)的染色方法相比，F(xiàn)J 染色可清晰標記腦及脊髓組織切片上變性神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突。FJ顯示變性神經(jīng)元的原理到目前為止仍不明確，可能變性的神經(jīng)元分泌堿性分子，與酸性的FJ 染料有很強的親和力，進而結(jié)合顯色。研究者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)JB 和FJC 與FJ 相比，染色時間更短，所需染料的有效濃度更低，背景色更淺，與變性神經(jīng)元的親和力更高，其中以FJC 的表現(xiàn)更為出色［20］。在腦出血的相關(guān)實驗研究中，Zhao 等利用SD 大鼠自體血注射模型在出血后1 d 分別對出血組和治療組進行腦組織冰凍切片F(xiàn)JC 染色，通過對出血灶周FJC 陽性細胞進行計數(shù)，明確灶周細胞變性死亡情況及治療效果［16］。Wu 等利用自發(fā)高血壓大鼠(SHR)自體血注射，切片后FJC 染色也能夠清晰顯示血腫灶周變性的神經(jīng)元，在SHR 大鼠血腫的周邊FJC 染色陽性細胞數(shù)量大于對照組［21］;同樣，F(xiàn)JC 染色還應用到豬自體血注射腦出血灶周細胞損傷的檢測［22］。FJC 在腦出血灶周變性細胞顯示方面也有不足之處，雖然能夠在高倍鏡下較好顯示出血灶周變性壞死的神經(jīng)元，但無法從整體去評估損傷的范圍和程度;此外，與染色方法有關(guān)，F(xiàn)JC 與其他抗體同時進行免疫熒光雙染的效果相對較差。

3 DNA 損傷檢測

腦出血與氧化損傷的關(guān)系首先在2000 年由Hall 等闡述［23］。氧化損傷通過多種途徑損傷腦組織，其中一個重要的途徑即直接DNA 損傷。與DNA 損傷和細胞死亡的關(guān)系明確。DNA 單鏈的損傷是通過裸露末端利用DNA 聚合酶Ⅰ介導的生物素標記的dATP 缺口平移(DNA polymerase mediated biotin-dATP nick-translation，PANT)染色法檢測;DNA 雙鏈的損傷是通過末端脫氧核營酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)進行檢測。Wu 等已在2002 年在實驗性大鼠裂解紅細胞基底節(jié)內(nèi)注射模型中證實出血后血腫內(nèi)紅細胞降解，導致周圍組織細胞內(nèi)出現(xiàn)氧化損傷，過氧化物歧化酶(Mn-SOD，Cu/Zn-SOD)水平明顯下降［24］。在灶周組織切片染色中，PANT 陽性細胞在裂解紅細胞注射后1 d 開始出現(xiàn)，2 d 達到高峰;而TUNEL 陽性細胞在注射后2～3 d 才開始出現(xiàn)，晚于PANT 染色，而在假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)兩種染色陽性細胞。認為氧自由基能夠直接損傷DNA，DNA 單鏈損傷在游離鐵離子的參與下被進一步加重，但單鏈損傷易于被修復。DNA 雙聯(lián)損傷則多被認為是凋亡的標志［25］。在鐵離子導致腦組織損傷的研究中，TUNEL、PANT 連同F(xiàn)JC 一起用于明確灶周細胞變性死亡情況及鐵螯合劑治療效果［16］。TUNEL 及PANT 染色用于顯示DNA 損傷，而DNA 具有自我修復功能，因而可能會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果;同樣與染色方法有關(guān)，TUNEL 及PANT 與其他抗體同時進行免疫熒光雙染定性的效果相對較差。

4 碘化吡啶(propidium iodide，PI)體內(nèi)注射

PI 是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNA 后釋放紅色熒光。PI 不能通過完整的細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。因此PI 經(jīng)常被用來與Calcein，AM 等熒光標記物一起使用，能同時在體外實驗中對活細胞和死細胞進行染色。PI-DNA 復合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為568nm和585nm。近年來，研究人員利用PI 來標記壞死細胞。當細胞膜破裂后，PI 進入細胞顯示紅色熒光，目前已經(jīng)應用于腦缺血，腦出血和腦外傷模型中［10，26，27］。在腦出血的相關(guān)研究中，利用小鼠基底節(jié)膠原酶注射腦出血模型，通過靜脈或者腹腔內(nèi)注射PI(1 μg/g 體重)，在不同時間點處死避光取腦切片后直接置于熒光顯微鏡下觀察腦出血血腫周邊組織內(nèi)細胞死亡情況，同樣，也可以與其他顏色熒光抗體進行免疫熒光染色，確定死亡細胞的類型(神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞或小膠質(zhì)細胞)和細胞死亡方式(壞死:PI +/TUNEL-;凋亡:PI-/TUNEL+;其他死亡類型:PI +/TUNEL +)［10］。在另一研究中，利用大鼠基底節(jié)自體血注射模型，PI(50 mg/ml，2 μl)與自體血100 μl 預混后腦內(nèi)注射，3 d 后處死避光切片在熒光顯微鏡下同樣能夠在血腫周邊找到大量PI 陽性細胞［12］。該方法的缺點在于操作過程需全程避光，熒光易淬滅，另外實驗過程中需排除PI 本身對腦組織的損害。

5 DARPP-32 免疫熒光染色

前面4 部分圍繞腦出血血腫周邊細胞死亡的判定和計數(shù)，量化方法均需高倍鏡在血腫周圍取點計數(shù)，很難對血腫灶周組織整體的損傷情況進行評估。在最近的研究中，發(fā)現(xiàn)DARPP-32 已經(jīng)被用作反映基底節(jié)損傷的神經(jīng)元標志物［11，28］。DARPP-32 蛋白是一個簡單且可以量化的指標，能夠在量化腦出血所致基底節(jié)神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要作用［12］。

DARPP-32 (Dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein，Mr 32 kDa)最早是在1983 年由Ivar Walaas 發(fā)現(xiàn)的，它是一個胞內(nèi)活性蛋白，存在于基底節(jié)中等大小棘神經(jīng)元內(nèi)，是多巴胺活化腺苷酸環(huán)化酶的一個重要靶點［29～32］，而紋狀體是大鼠基底節(jié)的主要組成成分［33］。紋狀體中標記DARPP-32 蛋白的中型棘神經(jīng)元占紋狀體細胞的95%以上。在超微結(jié)構(gòu)方面，DARPP-32 存在幾乎所有亞細胞結(jié)構(gòu)中，廣泛分布于細胞漿和軸突中［29］。研究血腫灶周組織損傷程度由DARPP-32 免疫熒光陰性區(qū)域和血腫之差來表示，在大鼠接受實驗性腦出血模型后，腦組織損傷從術(shù)后1 d 開始出現(xiàn)，3 d 到高峰，14 d 則明顯下降。DARPP-32 免疫印跡分析結(jié)果支持上述結(jié)果。在對PI 標記的切片進行DARPP-32 染色后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)二者所發(fā)射的熒光信號并無重合，血腫周圍為大量紅色PI 陽性細胞，而DARPP-32 則為陰性;而外圍DARRPP-32 陽性區(qū)域內(nèi)同樣找不到PI 陽性細胞，表明在基底節(jié)DARPP-32 熒光陰性區(qū)域能夠準確代表神經(jīng)元死亡范圍。去鐵敏(DFX)是一種鐵螯合劑，在以前研究中證明其能夠減輕腦出血所致的腦損傷［22，34］。該研究還利用DARPP-32 染色再一次驗證了鐵螯合劑對實驗性腦出血的治療作用(與對照組相比，治療組DARPP-32 陽性區(qū)域顯著擴大)。研究者發(fā)現(xiàn)，通過免疫印跡分析，DARPP-32 表現(xiàn)為位于32kDa 的一條清晰的條帶。對其進行組間像素的差異計算，可對腦出血后細胞損傷進行半定量分析。作為一種全新的方法，對于DARPP-32 在腦出血后基底節(jié)細胞死亡定量的價值尚需進一步研究支持。

6 結(jié)語

尋找能夠準確反映血腫灶周細胞損傷和死亡的標志物對于實驗性腦出血損傷機制的研究和治療方法的評估至關(guān)重要。一種準確、可靠的衡量出血灶周細胞死亡的方法需要具備靈敏度和特異性均高、操作方便、穩(wěn)定性好等特點。在研究實踐中，需要綜合分析各種染色方法的優(yōu)缺點，以期為實驗性腦出血的研究工作提供幫助。

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