甲潑尼龍沖擊治療對緩解復發(fā)型多發(fā)性硬化早期血清中IL-23和IL-17A水平的影響

梁軍利 趙麗君 錢琪 呂海東 袁利 馬曉麗

甲潑尼龍沖擊治療對緩解復發(fā)型多發(fā)性硬化早期血清中IL-23和IL-17A水平的影響

梁軍利 趙麗君 錢琪 呂海東 袁利 馬曉麗

目的 探討甲潑尼龍(MP)沖擊治療對復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(RRMS)患者血清中IL-23和IL-17A水平的影響。方法 選擇24例RRMS患者(RRMS組)及20例神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病患者(NIDNS組)，采用ELISA方法檢測MP沖擊治療(1.0 g 靜脈滴注 1次/d×3,之后0.5 g 靜脈滴注 1次/d×4)前后血清中IL-23、IL-17A的水平并計算陽性檢出率〔以治療前后450 nm處D(λ)值均為陰性對照D(λ)值的2.1倍以上者為陽性，陽性檢出率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%〕。結(jié)果 RRMS組IL-23和IL-17A陽性檢出率明顯高于NIDNS組(IL-23：79.17%vs. 35.00%，χ2=7.071，P=0.008；IL-17A：83.33%vs. 30.00%，χ2=10.725，P=0.001)；RRMS組治療后血清中IL-23、IL-17A水平〔分別(382.4±124.7) pg/mL；(32.8±20.2) pg/mL〕較治療前〔分別(610.6±102.5) pg/mL；(74.6±21.7) pg/mL〕明顯下降(IL-23:t=14.672,P=0.000；IL-17A：t=11.108,P=0.000)，但仍高于NIDNS組〔IL-23: (88.7±8.4) pg/mL，t=10.344，P=0.000；IL-17A：(18.1±0.9) pg/mL，t=9.205，P=0.000〕。結(jié)論 IL-23和IL-17A可能與MS發(fā)病有關，MP沖擊治療可降低RRMS患者血清中IL-23和IL-17A水平。

多發(fā)性硬化；甲潑尼龍；細胞因子

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，其發(fā)病機制仍不明確，目前研究認為與細胞因子失衡有關。目前已發(fā)現(xiàn)，一種以分泌IL-17為特征的Th17細胞與自身免疫反應有關，IL-23通過促進CD4+T細胞分泌炎性細胞因子IL-17A發(fā)揮其促炎效應，并提出了IL-23/IL-17軸發(fā)病機制學說[1]。目前，對IL-23、IL-17A在復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(relapsing remitting multiple sclerosis，RRMS)發(fā)病機制中的作用，以及糖皮質(zhì)激素(激素)治療對IL-23、IL-17A影響的研究，尚不完全清楚。本文通過檢測RRMS患者甲潑尼龍(MP)沖擊治療前后血清中IL-23和IL-17A水平，旨在探討IL-23、IL-17A在MS發(fā)病中的作用，以及激素治療對IL-23、IL-17A的影響。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 選擇2010-06-2013-06在焦作市人民醫(yī)院和解放軍第91醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的RRMS患者(RRMS組)24例，男8例、女16例；16～48歲，平均年齡(34.5±7.2)歲。入組標準：根據(jù)2005年McDonald診斷標準[1]確診為RRMS的患者，發(fā)病72 h內(nèi)入院，神經(jīng)功能障礙量表(EDSS評分)1.5～8分，激素治療后癥狀明顯減輕，EDSS評分減少>1分。排除標準：入院前3個月內(nèi)接受免疫調(diào)節(jié)治療(包括接受激素、環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑、干擾素制劑、考帕松和那他珠單抗等治療)患者；合并其他免疫相關疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、腫瘤等患者；合并顱內(nèi)外感染，如腦炎、腦膜炎等患者；腦卒中患者。

神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病(non inflammatory diseases of nervous system，NIDNS)患者20例作為對照組，其中男9例、女11例，年齡14～51歲，平均(35.2±9.5)歲，包括緊張性頭痛患者5例，周期性癱瘓患者15例，患者頭顱CT或MRI未見異常，腦脊液常規(guī)、生化、細胞學、寡克隆區(qū)帶、24小時免疫球蛋白G合成率檢查結(jié)果均正常。排除標準：(1)并發(fā)嚴重心、肝、腎功能不全；(2)腦出血、腦梗死及其他腦部合并癥；(3)急、慢性感染；(4)合并其他自身免疫性疾病；(5)腫瘤；(6)合并妊娠；(7)應用非甾體類抗炎藥物者，或6個月內(nèi)接受免疫抑制劑、激素或其他免疫治療。

兩組患者均簽署知情同意書。兩組之間性別和年齡的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法 所有NIDNS組和RRMS組患者，均于入院第二天上午采肘靜脈血5 mL，立即經(jīng)4000 r/min離心(離心半徑350 mm)5 min，取上清液分裝于分離管內(nèi)，標記，-80℃凍存待測。RRMS組患者給予MP(1.0 g 靜脈滴注 1次/d×3,之后0.5 g 靜脈滴注 1次/d×4)治療，同時加用護胃藥物、補鈣補鉀治療，共治療7 d后再次采肘靜脈血5 mL，同樣方法保存待測。

采用免疫酶聯(lián)雙抗體夾心ELISA法檢測NIDNS組及治療前后RRMS組血清中IL-23、IL-17A的水平，人IL-23和IL-17A ELISA試劑盒購自美國(R&D systems)。采用WE scanmk-2全自動酶免儀(芬蘭生產(chǎn))，微量加樣器。嚴格按照說明書操作。IL-23的靈敏度10 pg/mL，IL-17A的靈敏度2 pg/mL，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于5%。按照說明書，治療前后檢測時均設置復孔(同一樣品加到2個孔中，取平均值)。在ELISA檢測儀上，于450 nm處以空白對照孔調(diào)零后測各孔D(λ)值，若治療前后兩次檢驗結(jié)果均大于規(guī)定的陰性對照D(λ)值的2.1倍，即為陽性。陽性檢出率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。所有NIDNS組和治療前后RRMS組患者血清中IL-23和IL-17A水平(包括檢出率為陽性和陰性患者，計算復孔平均數(shù)為各樣本水平)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析。計量資料(NIDNS組和治療前后的RRMS組血清中IL-23和IL-17A水平)以均數(shù)±標準差表示，陽性檢出率以百分率表示，RRMS組治療前后血清中IL-23和IL-17A水平的比較采用配對t檢驗，RRMS組治療后與NNID組血清中IL-23和IL-17A水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，陽性檢出率的比較使用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者IL-23和IL-17A陽性檢出率比較 RRMS組患者IL-23陽性檢出率〔79.17%(19例)〕、IL-17A陽性檢出率〔83.33%(20例)〕明顯高于NIDNS組〔35.00%(7例)，χ2=7.071，P=0.008；30.00%(6例)，χ2=10.725，P=0.001)〕。

2.2 兩組IL-23和IL-17A水平比較 RRMS組治療后血清中IL-23、IL-17A水平〔分別(382.4±124.7)pg/mL；(32.8±20.2)pg/mL〕較治療前〔(610.6±102.5)pg/mL；(74.6±21.7)pg/mL〕明顯下降(IL-23:t=14.672，P=0.000；IL-17A：t=11.108，P=0.000)，但仍高于NIDNS組〔(88.7±8.4)pg/mL；(18.1±0.9)pg/mL〕(IL-23:t=10.344，P=0.000；IL-17A：t=9.205，P=0.000)。

3 討論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，其病因和發(fā)病機制復雜。既往研究發(fā)現(xiàn)，MS是Thl細胞介導的自身免疫性疾病，與Thl/Th2平衡失調(diào)相關，提出了細胞因子IL-12/γ-干擾素(IFN-γ)軸發(fā)病機制學說。Cua等[2]通過對MS的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)研究發(fā)現(xiàn)，IL-23在EAE的發(fā)病過程中起著比IL-12更為關鍵的作用。IL-23和IL-12都是P40家族成員之一，結(jié)構(gòu)非常相似，IL-12由P40和P35兩個亞單位組成，而IL-23由P40和P19兩個亞單位組成。對敲除P40基因的小鼠誘發(fā)EAE不敏感，而對敲除P35基因(即IL-12)的小鼠誘發(fā)EAE卻高度敏感，故認為IL-23是介導EAE的關鍵細胞因子[3]，因而推測IL-23/IL-17軸在MS發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[3]。

本研究采用ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)RRMS急性期血清中IL-23水平明顯高于NIDNS組，這和Chen等[5]的研究結(jié)果相一致。而Li等[4]發(fā)現(xiàn)MS患者IL-23在急性和慢性活動病灶中高表達，正常人腦組織中卻低表達甚至難以檢測到。本研究還發(fā)現(xiàn)，NIDNS組患者血清中IL-23的陽性檢出率極低，而RRMS組患者有很高的陽性檢出率，這也間接印證了Li等[4]的觀點。由于炎性反應與脫髓鞘病灶均與IL-23高表達相聯(lián)系，上述研究提示IL-23對于募集和激活誘導慢性炎性反應的炎性細胞具有重要作用，并可能在MS發(fā)病機制中占據(jù)重要地位。

IL-23能夠調(diào)節(jié)Thl7細胞的穩(wěn)態(tài)、擴增，是Thl7細胞存在的必需細胞因子[6]。Thl7細胞能夠分泌IL-17A、17F。IL-17A是主要由Th17細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學活性的早期炎性細胞因子[7]，可刺激成纖維細胞、內(nèi)皮細胞分泌如IL-6、IL-8、前列腺素E2、單核細胞化學趨化蛋白-1和粒細胞集落刺激因子等各種細胞因子，還可促進補體C3等急性期反應蛋白的產(chǎn)生，誘導炎性反應[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，RRMS組患者IL-17A水平及陽性檢出率也明顯高于NIDNS組，提示IL-17A可能與MS的發(fā)病密切相關，這和Chen等[5]、Muls等[9]的研究結(jié)果相一致。Steinman等[10]在人類MS損傷組織中發(fā)現(xiàn)了IL-17A表達；Li等[11]也發(fā)現(xiàn)，MS患者中記憶性Thl7細胞比例升高，且其升高程度與臨床癥狀嚴重程度相關，體外培養(yǎng)MS患者分離出的CD4+T細胞產(chǎn)生更多的IL-17。通過對IL-17受體缺乏和/或基因敲除IL-17小鼠在體和離體研究發(fā)現(xiàn)，IL-17受體缺乏和/或基因敲除IL-17小鼠與正常小鼠相比，前者EAE發(fā)生減少，發(fā)病的嚴重程度也減輕[12]。Golzari等[13]發(fā)現(xiàn)通過減少外周血單核細胞和血漿IL-17水平，可減輕炎性反應程度，減少女性MS患者的致殘率，改善預后。這些研究均提示阻斷IL-17通路，有可能成為治療MS的新途徑。

根據(jù)我國國情，干擾素制劑治療目前仍難以推廣，大劑量激素治療不良反應較多，且預防復發(fā)療效不確切，尋找有效替代藥物尤為重要。MP對治療急性期MS有效[14]，但預防其復發(fā)療效不確切，其作用機制尚不十分清楚。為了解MP對RRMS細胞免疫功能的影響，本研究中檢測了MP沖擊治療后RRMS患者血清中IL-23、IL-17A水平，發(fā)現(xiàn)治療后較治療前明顯減低，但仍高于對照組，提示MP可通過抑制IL-23/IL-17軸發(fā)揮抗炎作用。這可能是因為MP能夠抑制樹突狀細胞提呈抗原和共刺激信號，降低細胞間黏附因子和血管間黏附因子產(chǎn)生，從而抑制了Th17細胞激活及其通過血-腦脊液屏障的能力。雖然MS患者MP沖擊治療后臨床癥狀明顯減輕，但血清中IL-23、IL-17A水平仍高于對照組，是否適量延長激素治療時間至IL-23、IL-17A水平正常以預防MS復發(fā)，仍需進一步研究。

綜上可見，MP作為RRMS急性期治療用藥能夠明顯降低RRMS患者IL-23和IL-17A水平。IL-23和IL-17A是新近被認識到的在MS發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用的兩種細胞因子，是否通過抑制IL-23/IL-17軸治療及預防MS，仍需進一步的臨床研究。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Effect of methylprednisolone on the serum leves of IL-23 and IL-17A among patients with relapsing remitting multiple sclerosis

LIANGJunli*,ZHAOLijun,QIANQi,LVHaidong,YUANLi,MAXiaoli.

*DepartmentofNeurology,JiaozuoPeopleHospital，JiaozuoHenan454000，China

LIANG Jun-li, Email：godloveliangjunli@126.com.

Objective To investigate the serum levels of IL-23 and IL-17A in relapsing remitting multiple sclerosis (RRMS) patients after methylprednisolone pulse therapy . Methods ELISA method was used to detect the levels of IL-23 and IL-17A and the positive rate (450 nm D value 2.1 times more than the negative control D value both before and after treatment was defined as positive, the positive rate=positive cases/total number of cases multiplied by 100%)in 24 cases of RRMS patients before and after corticosteroid therapy(1.0 g，intravenous drip per day for three days and 0.5 g intravenous drip per day in the next 4 days) and 20 cases with non-inflammatory diseases of nervous system (NIDNS) patients. Results The detection rate of IL-23 and IL-17A in the RRMS group was significantly higher than the NIDNS group (IL-23:79.17%vs. 35.00%, χ2=7.071,P=0.008; IL-17A:83.33%vs. 30.00%, χ2=10.725,P=0.001); The levels of IL-23 and IL-17A descended in serum of RRMS patients after methylprednisolone pulse therapy [IL-23: (382.4±124.7) pg/mLvs. (610.6±102.5) pg/mL,t=14.672,P=0.000；IL-17A：(32.8±20.2) pg/mLvs. (74.6±21.7) pg/mL,t=11.108,P=0.000],but were still much higher than those in the NIDNS group [IL-23: (88.7±8.4) pg/mL,t=10.344,P=0.000；IL-17A：(18.1±0.9) pg/mL,t=9.205,P=0.000]. Conclusions IL-23 and IL-17A are associated with the pathogenesis of MS. Methylprednisolone pulse therapy can reduce the levels of IL-23 and IL-17A in sera of RRMS patients.

multiple sclerosis; methylprednisolone;cytokines

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.02.005

454000 焦作市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(梁軍利、錢琪、呂海東、袁利、馬曉麗)； 454000 中國人民解放軍91醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(趙麗君)

梁軍利，Email：godloveliangjunli@126.com

R744.5+1

A

1006-2963 (2015)02-0093-04

2014-09-03)