心臟干細胞研究進展與臨床應用

DOI：10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2015.03.17

基金項目：國家自然科學基金（81200151，81200708）；“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAI11B20）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項目（2013KTCL03－01）

作者單位：710032西安，第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心血管外科（孫　萌、段維勛、劉金成、俞世強、梁宏亮、金振曉），郵編城市名，山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院心臟內(nèi)科（孫　萌）

通訊作者：梁宏亮，Dr.lianghongliang@hotmail.com

1　背景

傳統(tǒng)學術觀點將心臟定義為一種終末分化的“靜止”器官，因檢測不到進行有絲分裂的心肌細胞，所以認為心臟在人出生后就無法再生出新的心肌細胞，心肌組織處于永恒的生長阻滯中。然而也有科學家提出：假如心肌細胞不能夠再生，那么出生后不斷生長的心臟，或由疾病造成的心臟質(zhì)量與體積的增加就只能夠通過單個細胞質(zhì)量與體積增加（細胞肥大）解釋。但研究表明單細胞的質(zhì)量、體積變化總和遠不能和整體心臟的質(zhì)量、體積變化匹配。事實上，心臟生長的原因不只是心肌肥大，更多是由心肌細胞數(shù)量增加造成的 ［1］。2009年Science報道科學家使用同位素標記方法證明：人類每年心肌細胞以1%左右的速度進行更新，健康人一生中約45%的心肌細胞來源于后天再生 ［2］。因此，雖然心肌細胞極少有絲分裂，但成體心臟一定存在新生心肌細胞來源。研究顯示心臟中存在一定數(shù)量的具有自我更新與分化能力的心臟干細胞（cardiac stem cells，CSCs）是心肌細胞再生的重要來源 ［3］。這顛覆了心臟是終末分化的“靜止”器官的舊觀點，表明心臟可自我更新、再生。也使人們逐漸認識到CSCs在心臟生理穩(wěn)態(tài)維持與病理再生修復中的關鍵作用，令研究CSCs成為國際熱點。特別是Lancet報道已將CSCs應用于缺血性心臟的臨床治療，取得了良好療效，為此類患者的治療帶來了新的希望 ［4－5］。本文就CSCs的基本性質(zhì)與臨床應用做以綜述。

2　心臟干細胞的分類與來源

Bergmann研究 ［2］發(fā)現(xiàn)在年輕人心肌細胞更新率為1%／年，老年人0.5%／年。CSCs理論上是心肌再生和間質(zhì)細胞再生的來源之一。CSCs具有自我更新、克隆形成、多種分化潛能干細胞的特性，并且在體內(nèi)、外能分化成心肌細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞。據(jù)CSCs表面的標志和來源不同CSCs可分為：c－kit ＋／Lin CSCs ［6］、Sca－1 ＋CSCs ［7－8］、lsl1 ＋CSCs ［9］、側群CSCs（the cardiac side population） ［10－11］、SSEA－1 ＋CSCs ［12］、心外膜來源干細胞（Epicardium－derived cells） ［13］等類型。這些不同種類的CSCs之間存在一定的交叉，表達不同標志物的CSCs可能是同一種CSCs，或是CSCs發(fā)育不同階段表達的不同標志物，也可能是不同的CSCs特有的標志。Quaini等 ［14］通過性別錯配心臟移植的實驗研究，認為心臟干細胞來源于骨髓。但隨著研究的進一步深入，大量的實驗結果顯示CSCs來自心臟，成體心臟存在心臟干細胞巢 ［15］。CSCs可被發(fā)現(xiàn)于心房、心室、房室溝、心外膜 ［16－18］，但分布不均勻，分布與組織所承受的壓力成反比 ［19］，心房多于心室 ［20］。Itzhaki－Al?fia等 ［21］的研究顯示從患者右心耳分離出來的ckit ＋CSCs多于心臟其他部位。

3　心臟干細胞的分離與擴增

分離、培養(yǎng)獲取可用于治療的足夠數(shù)量CSCs是臨床應用的主要瓶頸之一。目前分離CSCs主要包括經(jīng)皮心內(nèi)膜心肌活檢法和外科手術法。外科手術方法最常獲取右心耳組織，相對安全，c－kit ＋／Lin －CSCs含量較多 ［21］。但由于開胸創(chuàng)傷大，應用比較局限。經(jīng)皮心內(nèi)膜心肌活檢技術在臨床較常應用，創(chuàng)傷性小，安全性高，較易于患者接受，且不易受疾病類型的影響。不足之處是獲取組織量相對有限。但隨著分離、培養(yǎng)技術的改進，即使少量組織量也能擴增獲得治療量的CSCs ［22］。目前的培養(yǎng)擴增的方法有：在培養(yǎng)基中加入細胞因子，如胰島素樣生長因子1、堿性成纖維細胞生長因子；培養(yǎng)條件預處理，如缺氧環(huán)境下，CSCs開始表達一些利于存活的信號蛋白和生血管因子，如血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導因子－1α、CXCR4等 ［23］。Tang等 ［24］研究表明，缺氧預處理提高了CSCs對心肌梗死的療效。

4　心臟干細胞的移植途徑與示蹤

CSCs的存在使心臟像肝臟、腦和皮膚組織一樣具有再生功能和自我修復能力。在動物急、慢性心肌梗死，缺血性心肌病模型中，自體或異體CSCs經(jīng)過體外分離、培養(yǎng)、增殖后，可通過不同途徑進行移植并具有各自的特點：①靜脈內(nèi)注射：無創(chuàng)且易操作，但細胞輸送效率低，大量移植細胞滯留于心臟外組織 ［25］，且CSCs的全身分布與影響不清楚；②心肌內(nèi)注射：避免開胸，比經(jīng)動靜脈輸注所需干細胞數(shù)量少，經(jīng)超聲或肌電圖引導下經(jīng)皮以導管為基礎的心肌內(nèi)注射，肌電圖可描繪和分辨瘢痕組織及存活的心肌，因此可直達目標部位；但由于采用心臟手術方式的侵入性操作存在術中和術后風險且需特殊導管和影像技術 ［26］；③冠狀動脈內(nèi)注射：可于第一時間內(nèi)在梗死部位及其周邊區(qū)域移植最大限度的干細胞，但輸送的有效性不確定，有發(fā)生栓塞的風險；④開胸心外膜注射：外科手術中在直視下注入CSCs，但創(chuàng)傷較大存在手術風險；注入體內(nèi)CSCs的示蹤方法有：①放射標記物標記后通過PET和SPECT定位；②鐵粒子標記，通過MRI觀察；③基因標記如生物熒光，進行在體熒光成像。

5　心臟干細胞修復心臟的機制

CSCs具有自我更新，集落生長和多潛能等特性，在心梗動物模型在體實驗中顯示具有大量再生的潛力 ［27］，能分化成為心肌細胞，平滑肌細胞，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞。目前，c－kit ＋CSCs被認為是心肌再生治療的最合適的細胞類型。其對心臟穩(wěn)態(tài)的維持及損傷修復的機制可能有以下幾個方面：一是直接分化機制 ［24］，c－kit ＋內(nèi)源性CSCs對損傷的心肌有很強的趨向性，移植到受損心臟后可以分化成心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，通過增加心臟功能細胞的數(shù)量或者來自細胞間的協(xié)同作用，從而改善心臟功能。有實驗證明長期培養(yǎng)CSCs ［28］，可上調(diào)GATA－4表達，增強心肌細胞分化能力，證明高表達GATA－4／c－kit ＋CSCs有很強的心臟再生潛力。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)中的β1整合素可通過MAPK通路調(diào)節(jié)CSCs的存活，也可以通過Rho及Wnt信號傳導影響CSCs分化中Cx40和Cx43的表達。另外，梗死灶邊緣的殘存心肌細胞可通過細胞間連接與CSCs建立聯(lián)系，傳遞終末分化信息，誘導其向心肌方向分化，并有利于實現(xiàn)其與周圍心肌同步舒縮。二是通過自分泌和旁分泌機制 ［24］分泌促血管生成及保護心臟的多種生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、胰島素樣生長因子1 （IGF－1）、肝細胞生長因子（HGF）、可溶性血管細胞黏附分子1（sVCAM－1）、基質(zhì)細胞衍生因子1 ［27］。當c－kit ＋CSCs與成熟心肌細胞共同培養(yǎng)時 ［29］，由于上調(diào)VEGF、IGF－1表達，通過激活Akt信號通路，可以增加CSCs數(shù)量，增強心肌細胞存活能力，當ckit ＋CSCs植入心肌梗死大鼠心臟后 ［28］，可分化成心肌細胞和血管結構，產(chǎn)生許多新的再生心肌，促進心臟功能的修復，從而改善心功能。目前的研究表明，IGF－1和VEGF是特殊的生長因子，可增加培養(yǎng)基營養(yǎng)，從而增強心肌細胞存活能力。其中sVCAM－1 ［30］被認為是主要的旁分泌信號因子之一，通過激活Akt，ERK，p38 MAPK等蛋白激酶誘導內(nèi)皮細胞和CSCs的遷移及血管生成，在氧化應激的條件下，預防心肌細胞死亡，保護心臟，其在對心臟損傷的修復過程中起關鍵作用。旁分泌的細胞因子有抗凋亡作用，從而改變細胞外基質(zhì)，吸引更多內(nèi)源性CSCs。但細胞直接轉(zhuǎn)化和長期存活非常有限。需要指出的是旁分泌作用包括兩個不同的效應：第一個是體液刺激內(nèi)源性再生，第二個是保護現(xiàn)有的細胞 ［31］。多數(shù)實驗結果顯示c－kit ＋CSCs對心臟穩(wěn)態(tài)的維持及損傷修復機制中的旁分泌作用大于心臟干細胞的直接分化作用 ［27］。此外，活化的CSCs通過細胞融合對損傷的冠脈血管修復也起一定的作用。

6　心臟干細胞的臨床應用

CSCs具有定向分化心臟細胞的特性且致瘤率低，自體移植后不存在免疫排斥反應和倫理道德問題且可凍存，重復多次使用。這些特點更適合應用于臨床治療。大量動物實驗顯示，c－kit ＋CSCs可改善心肌梗死后的左室功能紊亂，生成新的心肌細胞從而增加心肌細胞的數(shù)量及局部毛細血管密度，改善局部缺血心肌細胞的血液供應，修復缺血受損的心肌細胞，改善心臟收縮、舒張末期的容積從而抑制心室重構，改善左室射血分數(shù)和血流動力學，提高心臟功能，從根本上達到治療缺血性心肌病的目的。盡管如此，CSCs移植入人體內(nèi)的有效性還是不太明確的。2009年2月，Bolli等 ［4］人開始了自體CSCs移植治療缺血性心肌病的Ⅰ期臨床試驗（SCIPIO）?；颊叩募{入標準為心肌梗死后、射血分數(shù)≤40%且接受過冠狀動脈旁路移植手術。實驗方法是手術后4個月的患者經(jīng)冠脈內(nèi)重新移植從右心耳分離出的自體性心臟干細胞，對照組沒有接受治療。在A階段，對治療組的9位患者與對照組的4位患者進行連續(xù)性評估自體CSCs移植后的短期安全性和可行性。在B階段，患者以2∶3的比例使用劃分為5塊大小的隨機性方案納入治療組和對照組。納入后評估其連續(xù)時間內(nèi)的安全性和有效性的終點事件。結果顯示81例患者中，80例患者自體性CSCs成功分離并擴增。16位治療組的患者沒有觀察到不良反應。三維心臟超聲顯示移植CSCs后4個月左室射血分數(shù)從（30.3±1.9）%增至（38.5±2.8）%，局部室壁運動得到改善，且患者生活質(zhì)量有了一定的提高。相反地，對照組7位患者在相應的間隔時間內(nèi)沒有明顯地改變。更重要的是自體CSCs移植1年后左室射血分數(shù)較前提高了（12.3±2.1）%，對心臟功能有更顯著的改善作用。7位治療組的患者通過心臟MRI顯像心肌梗死面積在4個月減少了23.8%，1年減少了30.3%。因此，SCIPIOⅠ階段實驗證明通過冠脈內(nèi)移植自體CSCs治療缺血性心肌病是可行、安全的，治療1年后可以明顯改善左室收縮功能，取得一定的臨床療效。SCIPIOⅡ階段需要對自體CSCs移植提供大量的臨床數(shù)據(jù)，為指導臨床治療提供有效的依據(jù)。2009年5月，Makkar等 ［5］人開始了（CADUCEUS）自體CSCs移植逆轉(zhuǎn)左室功能紊亂的前瞻性、隨機性研究?；颊呒{入標準為心肌梗死后2至4周且左室射血分數(shù)為25%～45%。以2∶1的比例隨機分配患者接受自體CSCs移植治療或標準治療。Ⅰ階段實驗結果顯示自體CSCs移植24 h后沒有并發(fā)癥，治療6個月后射血分數(shù)提高且沒有患者死亡或發(fā)展心臟腫瘤等副作用。自體CSCs移植治療6個月，12個月后與對照組相比，心臟MRI提示瘢痕質(zhì)量占左室質(zhì)量從基礎值24%分別減少7.7%，12.3%（P＝0.001），對照組僅減少0.3%，2.2%。同時增加了有效的心臟質(zhì)量（P＝0.01），局部收縮力（P＝0.02）和局部收縮厚度（P＝0.015）。提示自體CSCs移植治療后可以減少心肌梗死面積，刺激健康心肌組織的再生長的同時改善局部室壁運動。雖然有兩項臨床研究證明骨髓干細胞治療可以減少心肌梗死面積，但CSCs治療比其治療效果更明顯。盡管如此，CSCs治療的有效性仍需要大規(guī)模的臨床研究。

7　結語

雖然針對CSCs已有大量的動物實驗研究，但目前的結果并不能滿足臨床的需要，還有很多問題有待解決：CSCs是否受到疾病狀態(tài)的影響？CSCs在不同分化階段是同一細胞類型嗎？CSCs的移植方式和最佳時機的選擇？CSCs自身的穩(wěn)態(tài)平衡及動態(tài)變化是如何調(diào)控的？如何使用有效的方法獲得足夠數(shù)量的高純度CSCs？如何提高CSCs移植后的存活率、增殖能力及分化率？如何最有效地追蹤CSCs移植后的命運？目前對于CSCs治療缺血性心肌病的機制存在爭議，更多證據(jù)傾向于旁分泌機制，但具體的信號通路及作用機制有待進一步探討和完善。雖然有大量的動物實驗證明自體CSCs移植具有廣闊的臨床應用前景，但開展的臨床試驗仍較少且觀測時間不夠長，缺少大樣本量的臨床試驗，這些都需要更進一步的研究和論證。