高血壓患者外周血白細(xì)胞膽固醇流出相關(guān)基因表達(dá)的變化

仝其廣，吳長燕，岳志剛，徐慧，劉婭，毛雯，張苗苗，吳迪，劉鵬，胡大一

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高血壓患者外周血白細(xì)胞膽固醇流出相關(guān)基因表達(dá)的變化

仝其廣，吳長燕，岳志剛，徐慧，劉婭，毛雯，張苗苗，吳迪，劉鵬，胡大一

目的研究高血壓患者外周血白細(xì)胞膽固醇流出相關(guān)基因表達(dá)的狀況。方法選擇2013年3月～2013年5月在煤炭總醫(yī)院心內(nèi)科門診就診或體檢的患者。高血壓患者13例，其中男性7例，女性6例，平均年齡（66.54±11.72）歲。對照組（健康體檢者）11例，其中男性8例，女性3例，平均年齡（62.36 ±9.27）歲。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，測定高血壓患者和健康體檢者外周血白細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ABCG1）和載脂蛋白A1（ApoAI）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與對照組比較，高血壓組ABCA1mRNA表達(dá)降低[（2.38±0.82） vs. （0.47±0.20）]，ApoAI表達(dá)也降低[（2.19±0.86） vs. （0.11±0.06）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。兩組ABCG1的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論高血壓患者外周血白細(xì)胞膽固醇流出基因的表達(dá)下降，這可能是高血壓導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

高血壓；ApoAI；ABCA1；ABCG1

細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出是維持細(xì)胞膽固醇平衡的重要機(jī)制，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ATP binding cassette transporter G1，ABCG1）控制細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，載脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，ApoA1）是經(jīng)ABCA1旁路膽固醇流出的細(xì)胞外主要受體。作為高密度脂蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白，ApoA1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中接受外周細(xì)胞內(nèi)的膽固醇并轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝，對動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用。而這些因子的協(xié)同作用是保持細(xì)胞內(nèi)膽固醇動(dòng)態(tài)平衡的基礎(chǔ)。高血壓和血脂異常是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，二者在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。而高血壓常伴血脂異常。本研究探討了高血壓患者是否存在膽固醇流出基因的表達(dá)異常，為揭示二者間的關(guān)系提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2013年3月～2013年5月在煤炭總醫(yī)院心內(nèi)科門診就診或體檢的患者。高血壓患者13例，其中男性7例，女性6例，平均年齡（66.54±11.72）歲。對照組（健康體檢者）11例，其中男性8例，女性3例，平均年齡（62.36± 9.27）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：新發(fā)原發(fā)性高血壓患者，未服用降壓藥物；或既往有原發(fā)性高血壓病史自行停用降壓藥物2周以上者。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)：在未服用降壓藥物的情況下，非同日3次測量血壓，收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg（1mmHg=0.133 kPa）。排除繼發(fā)性高血壓、糖

尿病、急性冠脈綜合征和腦卒中、入院前一個(gè)月內(nèi)服用他汀或其他降脂藥物、心力衰竭、嚴(yán)重肝腎功能損害、血液病、甲狀腺疾病、腫瘤、絕經(jīng)后婦女用激素替代治療。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)指標(biāo)測定清晨空腹12 h以上取靜脈血，分離血清測定血脂、血糖、血清肌酐、尿素氮和高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）等生化指標(biāo)，均由貝克曼AU2700全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)檢測。試劑由日本第一化學(xué)藥品株式會社、北京中生北控有限公司和德賽公司提供。

1.2.2 外周血白細(xì)胞ApoAI mRNA表達(dá)測定RNA提取：清晨空腹取靜脈血2 ml置入EDTA抗凝管內(nèi)，離心棄去血漿，分離出血細(xì)胞，并加入RNA保存液中，-80℃冰箱保存，一周內(nèi)采用試劑盒按照說明書提取外周血白細(xì)胞RNA。檢測所有標(biāo)本RNA純度、濃度和完整性?；虮磉_(dá)：白細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系（20 l體系）：RNA 3 μl，5×Buffer4 μl，dNTP1 μl，Oligo（dT）1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，DEPC H2O 10.5 μl。逆轉(zhuǎn)錄程序：42℃保溫60 min。95℃5 min，4℃5min，迅速放入-20℃長期凍存。熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μl含：基因組cDNA 2μl，上游和下游引物分別為5 pmol，dNTPmix 5nmol，Taq酶1U，Taq酶緩沖液2.5 μl及滅菌去離子水適量，應(yīng)用自動(dòng)循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃ 5 min，反應(yīng)循環(huán)為：變性94℃ 30 s、退火61℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min?；騧RNA表達(dá)以β-actin標(biāo)化。β-actin上游引物：5’-TCCTTCT GCATCCTGTCGGCA-3’，下游引物：5’-CAA GAGATGGCCACGGCTGCT-3’。ApoAI基因上游引物：5’- CCGCCGTTCTCCTTGAGAG-3’，下游引物：5’- AGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATG -3’。ABCA1基因上游引物：5’-GGCTGTGT CTCGTATTGTCTG-3’，下游引物：5’-CCTT GTGGCTGGAGTGTCA-3’。ABCG1上游引物：5’-AGAAAGACTTTGAAAGAGTT-3’，下游引物：5’-GGTAAATCACATACTTTGTT-3’。RNA提取和引物合成以及熒光定量PCR均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA分析。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。參數(shù)間相關(guān)分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較兩組在年齡、性別比例、體質(zhì)指數(shù)、血脂水平、尿素氮、載脂蛋白A1、載脂蛋白B、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

2.2 外周血白細(xì)胞膽固醇流出基因mRNA表達(dá)與對照組比較，高血壓組ABCA1mRNA表達(dá)降低[（2.38±0.82） vs. （0.47±0.20）]，ApoAI表達(dá)也降低[（2.19±0.86） vs. （0.11±0.06）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。兩組ABCG1的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

2.3 膽固醇流出基因mRNA表達(dá)與血脂相關(guān)性分析血清HDL-C和ApoAI水平與ApoAI mRNA表達(dá)無明顯相關(guān)（P=0.491或P=0.343），也與ABCA1 mRNA表達(dá)不相關(guān)（P=0.434或P=0.631）。

3 討論

高血壓常伴有血脂代謝異常，高血壓患者是否存在脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)異常，尚不清楚。本研究采用熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，原發(fā)性高血壓患者外周血白細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)降低，而ABCG1未見改變。Korkor KT等[1]研究采用微陣列技術(shù)觀察高血壓患者外周血細(xì)胞基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓者ABCA1和ABCG1表達(dá)下調(diào)，但未以實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行測定。Xu等[2]結(jié)果表明，與健康對照組比較，高血壓患者外周血單

核細(xì)胞ABCA1和ABCG1mRNA表達(dá)下降。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高血壓患者外周血單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞膽固醇流出能力降低。有研究報(bào)道[3]，高血壓患者外周血白細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因表達(dá)研究中，未見ABCA1 mRNA變化。原因不清，不除外年齡因素，該文獻(xiàn)中高血壓患者平均年齡（43.26±11.69）歲，而本研究為老年高血壓患者（66.54±11.72）歲。有研究顯示[4]，基因表達(dá)存在性別差異，男性ABCA1表達(dá)降低，而女性高血壓患者ABCA1和ABCG1mRNA表達(dá)都降低。鑒于本研究樣本量小，未行不同性別分析。

本研究中高血壓患者白細(xì)胞APOA1 mRNA表達(dá)明顯低于對照者。APOA1是HDL的主要構(gòu)成部分，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。由于APOA1接受經(jīng)ABCA1控制的來自外周組織或細(xì)胞流出的膽固醇，成熟高密度脂蛋白（HDL）主要接受經(jīng)由ABCG1控制的膽固醇外流，因此，可能影響到細(xì)胞膽固醇流出和動(dòng)脈粥樣硬化。

進(jìn)一步觀察，ABCA1和APOA1表達(dá)與血清HDL-C和APOA1水平無關(guān)，提示外周血白細(xì)胞ABCA1和APOA1 mRNA基因表達(dá)并沒有影響抗動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白的血清水平。APOA1是HDL的主要載脂蛋白，主要來源于兩個(gè)方面[5]：由肝細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞合成與分泌，也可由成熟HDL分解代謝而來，并在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。所以，外周血白細(xì)胞APOA1 mRNA基因表達(dá)并未影響血漿HDL-C和APOA1水平。肝細(xì)胞ABCA1等基因表達(dá)對血清HDL-C水平具有決定性作用，而不受外周血細(xì)胞基因表達(dá)的影響[6,7]。

高血壓與細(xì)胞膽固醇流出基因表達(dá)也存在內(nèi)在聯(lián)系。ABCA1V825I基因型與高血壓有關(guān)[8]。另一方面，高血壓可引起活性氧（ROS）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）增加[9-11]，而ROS和AGEs可下調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1與ABCG1的表達(dá)，高血壓可能通過這一途徑調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。炎癥可能是導(dǎo)致ABCA1基因表達(dá)下調(diào)的一個(gè)因素。CRP作為炎癥的標(biāo)志物在高血壓患者中升高[12-14]。體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)和高血壓患者研究顯示[4,15]，CRP抑制細(xì)胞膽固醇流出基因表達(dá)，CRP水平與ABCA1和ABCG1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。提示炎癥因素可能影響細(xì)胞膽固醇流出基因表達(dá)。本研究中高血壓患者h(yuǎn)s-CRP較健康對照組升高，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能受到樣本量偏小的影響。

外周血白細(xì)胞基因表達(dá)變化與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)[16]。因此，高血壓患者除了由血壓升高這一傳統(tǒng)因素對于心血管系統(tǒng)造成損害之外，還可能通過細(xì)胞膽固醇流出途徑有關(guān)基因表達(dá)異常而影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡、引起動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

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Changes of expressions of cholesterol efflux genes in peripheral blood leukocytes in hypertensive patients

TONG Qi-guang*, WU Chang-yan, YUE Zhi-gang, XU Hui, LIU Ya, MAO Wen, ZHANG Miao-miao, WU Di, LIU Peng, HU Da-yi.*Heart Center, China Meitan General Hospital, Beijing 100028, China.

ObjectiveTo study the expressions of cholesterol efflux genes in peripheral blood leukocytes in hypertensive patients.MethodsThe patients [hypertension group, n=13, male 7, female 6 and average age=(66.54 ±11.72)] and health cases [control group, n=11, male 8, female 3 and average age=(62.36±9.27)] were chosen from Mar. 2013 to May 2013. The mRNA expressions of apolipoprotein A1 (ApoA1), ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) and ATP binding cassette transporter G1 (ABCG1) in peripheral blood leukocytes were detected by using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) in 2 groups.ResultsCompared with control group, ABCA1 mRNA expression decreased [(2.38±0.82) vs. (0.47±0.20)] and ApoAI mRNA expression also decreased [(2.19±0.86) vs. (0.11±0.06)] in hypertension group (all P＜0.05). The expression of ABCG1 mRNA had no statistical difference between 2 groups (P＞0.05).ConclusionThe decreased expressions of cholesterol efflux genes in peripheral blood leukocytes may be one of mechanisms of hypertension resulting in atherosclerosis in hypertensive patients.

Hypertension; Apolipoprotein A1; ATP binding cassette transporter A1; ATP binding cassette transporter G1

R544.1

A

1674-4055(2015)02-0196-03

2014-10-21）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金(2007-3127)

共同第一作者：吳長燕

100028 北京,北京煤炭總醫(yī)院心臟中心(仝其廣,岳志剛,徐慧,劉婭,毛雯,張苗苗,吳迪,劉鵬);首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科(吳長燕);北京大學(xué)人民醫(yī)院心臟中心(胡大一)

胡大一,E-mail:dayi.hu@medmail.com.cn

10.3969/j.1674-4055.2015.02.13