青光眼神經(jīng)保護(hù)基因治療的研究進(jìn)展

麥爾哈巴·肖開提 莫曉芬

·綜 述·

青光眼神經(jīng)保護(hù)基因治療的研究進(jìn)展

麥爾哈巴·肖開提 莫曉芬

青光眼以進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的丟失及其軸突變性為特征，其臨床表現(xiàn)為典型的視神經(jīng)萎縮和視野缺損。因此，延緩或阻止RGCs凋亡的神經(jīng)保護(hù)性措施應(yīng)作為主要治療手段。本文通過補(bǔ)充神經(jīng)營養(yǎng)因子，調(diào)控線粒體功能，抑制細(xì)胞凋亡通路和毒性作用等幾個(gè)層面，對(duì)基因治療在RGCs抗凋亡和促進(jìn)存活作用的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：437-440)

青光眼是一類以特異性的視神經(jīng)損害和視野缺損為特征的眼病，已成為白內(nèi)障后第2位致盲性眼病。最新研究[1]結(jié)果顯示，至2020年，全世界青光眼患者的數(shù)量將達(dá)到7 000萬。青光眼主要的病理變化是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的不可逆喪失。目前對(duì)青光眼的治療，主要以藥物或手術(shù)的方法降低眼壓，可是相當(dāng)一部分患者盡管眼壓控制滿意，但視功能還繼續(xù)惡化；究其根源，是由于發(fā)生細(xì)胞凋亡的病理微環(huán)境持續(xù)存在，使得神經(jīng)元數(shù)量不斷減少，造成視功能進(jìn)行性下降。因此尋找更為有效的治療方法保護(hù)神經(jīng)元或延緩其凋亡迫在眉睫。基因治療因具有組織特異性高、可長時(shí)間持續(xù)等特點(diǎn)，對(duì)此類慢性終身性疾病的治療具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，因而受到業(yè)界的關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)[2]。

至今為止，有研究[3]報(bào)道了在各類青光眼患者中至少存在29個(gè)異?；蛭稽c(diǎn)，其中已明確12個(gè)為致病性基因。但是在實(shí)行基因治療前，需要進(jìn)一步明確青光眼基因缺陷和RGCs凋亡病理生理間的關(guān)系。此外，除了基因缺陷因素，還有個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)因素、環(huán)境因素均可以影響青光眼的發(fā)生和發(fā)展。由于上述原因，目前對(duì)青光眼基因治療策略，主要考慮如何增強(qiáng)RGCs的存活和再生，而非單純修正遺傳缺陷。

隨著病毒和非病毒基因載體的出現(xiàn)，更多的研究證實(shí)了基因治療在保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元、延緩RGCs凋亡方面的功效。因此，本文對(duì)基因治療在RGCs抗凋亡和促進(jìn)存活方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 基因治療載體

1.1 腺相關(guān)病毒載體 腺相關(guān)病毒(adeno- associated virus，AAV)是一種小的單鏈DNA病毒，具有非免疫原性、基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。在成年大鼠玻璃體腔注射AAV載體，能有效地轉(zhuǎn)染RGCs，轉(zhuǎn)染率達(dá)到68%[6]；而在視網(wǎng)膜下腔注射AAV載體，主要轉(zhuǎn)染感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮層[7-8]。目前應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染的AAV載體具有9種血清型，其中AAV-6載體對(duì)RGCs的轉(zhuǎn)染率較低，只有24%，其他血清型對(duì)RGCs的轉(zhuǎn)染率為57%～71%，其中AAV-2最高[9]。

1.2 腺病毒載體 最初的腺病毒(adenovirus，Ad)又叫復(fù)制缺陷病毒，具有穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染率高等優(yōu)點(diǎn)，但由于強(qiáng)免疫原性及毒性反應(yīng)，研究者對(duì)Ad載體進(jìn)行了改進(jìn)。第3代Ad載體又叫輔助病毒依賴性Ad載體(helper-dependent adenovirus，Hd-Ad )，此類病毒基因只保留了兩段復(fù)制區(qū)域，其他結(jié)構(gòu)被外源基因序列所替代。這種新病毒載體由于缺失大部分病毒編碼序列，因而有效地減少了機(jī)體的免疫反應(yīng)，使基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間明顯延長[10]。Ad載體能夠有效地轉(zhuǎn)染上皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。研究[11]發(fā)現(xiàn)，在小鼠玻璃體腔注射Hd-Ad-GFP載體，基因產(chǎn)物在Müller細(xì)胞中能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)可長達(dá)1年。在視網(wǎng)膜下腔注射Hd-Ad載體，能有效地轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮層[12]。

1.3 非病毒載體方法 與病毒載體相比，非病毒載體基因轉(zhuǎn)染方法相對(duì)安全，不會(huì)引起免疫反應(yīng)；但轉(zhuǎn)染率低、持續(xù)時(shí)間較短。電穿孔方法是物理導(dǎo)入方法之一, 具有操作簡單、安全、轉(zhuǎn)染率不受細(xì)胞增殖性影響等優(yōu)點(diǎn), 是一種良好的外源基因?qū)胂到y(tǒng)。研究顯示，在SD大鼠視神經(jīng)橫斷傷模型及視網(wǎng)膜色素變性大鼠模型上，利用此方法成功地將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor ，BDNF)轉(zhuǎn)染到RGCs層或視網(wǎng)膜色素上皮層，觀察到基因治療后能產(chǎn)生持久顯著的神經(jīng)元保護(hù)效果[13-14]。

2 基因治療策略

2.1 補(bǔ)充神經(jīng)營養(yǎng)因子 神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的存活、分化及建立突觸聯(lián)系至關(guān)重要，營養(yǎng)因子的剝奪是誘發(fā)青光眼RGCs凋亡的重要因素之一。已有研究表明，眼內(nèi)注射神經(jīng)營養(yǎng)因子能暫時(shí)性拯救損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)元，采用基因治療的方法轉(zhuǎn)染這些神經(jīng)營養(yǎng)因子，起到更好地持久保護(hù)效果并能克服眼內(nèi)多次注射帶來的各種并發(fā)癥。

2.1.1 BDNF 在神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中，BDNF對(duì)受損RGCs的保護(hù)作用尤為突出。玻璃體腔局部注射外源性BDNF蛋白可以促進(jìn)視神經(jīng)損傷后RGCs的存活，通過病毒載體或活體電穿孔輔助技術(shù)，將外源性BDNF基因轉(zhuǎn)染到RGCs層，其保護(hù)效應(yīng)更持久。Martin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠慢性高眼壓模型上，玻璃體腔單次注射AAV-BDNF治療，治療組比對(duì)照組能顯著增加RGCs的存活率。盡管BDNF具有顯著的神經(jīng)保護(hù)效果，但這種作用是暫時(shí)性的。BDNF能延緩RGCs的凋亡，卻不能阻止凋亡進(jìn)展，這跟RGCs表面TrkB受體的表達(dá)下調(diào)相關(guān)[16]。研究[6]表明，在視神經(jīng)橫斷傷大鼠模型上，利用AAV載體將TrkB基因轉(zhuǎn)染到RGCs層，玻璃體腔注射BDNF蛋白，能顯著提高對(duì)RGCs保護(hù)效果及延長作用時(shí)間。

2.1.2 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是具有保護(hù)RGCs和促進(jìn)軸突再生作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在多種視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中，外源性補(bǔ)充CNTF起到顯著的神經(jīng)保護(hù)和再生效果。在大鼠慢性高眼壓模型中，玻璃體腔注射AAV-CNTF治療，與對(duì)照組相比存活的RGCs軸突數(shù)量超過15%[17]。NT-501是Neurotech公司研發(fā)的一種分泌CNTF的植入裝置，通過細(xì)胞封裝技術(shù)將分泌CNTF的細(xì)胞系裝入一種生物半透膜而制成，NT-501通過手術(shù)植入到睫狀體平坦部后，能穩(wěn)定地分泌CNTF。這種裝置已經(jīng)通過了視網(wǎng)膜色素變性和老年黃斑變性的第2期臨床試驗(yàn)[18]，并于2011年開始進(jìn)入了原發(fā)性開角型青光眼第1期臨床試驗(yàn)(clinical trials.gov NCT01408472)，其療效值得期待。

2.1.3 色素上皮源性因子 色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種具有抑制內(nèi)源性新生血管形成和神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為50×103。Miyazaki等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在Wistar大鼠急性缺血再灌注模型中，視網(wǎng)膜下腔注射猿猴免疫缺陷病毒(SIV)載體表達(dá)的人類PEDF基因(SIV-hPEDF)，結(jié)果表明，PEDF過表達(dá)能明顯提高受損視網(wǎng)膜神經(jīng)元的存活率。又有學(xué)者[20]發(fā)現(xiàn)，在成年大鼠視神經(jīng)挫傷模型中，玻璃體腔注射PEDF還具有促進(jìn)RGCs軸突生長的效果，聯(lián)合環(huán)磷酸腺苷(cyclicAMP，cAMP)治療，軸突延長作用更加顯著。

2.1.4 其他 除了上述神經(jīng)營養(yǎng)因子之外，成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF)也同樣具有神經(jīng)保護(hù)效果[21]。研究[22]表明，視神經(jīng)損傷后，F(xiàn)GF-2在視網(wǎng)膜內(nèi)核層及RGCs層的表達(dá)上調(diào)；在大鼠神神經(jīng)損傷模型上，經(jīng)玻璃體腔注射AAV-FGF-2載體，能誘導(dǎo)損傷后RGCs軸突的延長。在大鼠視神經(jīng)橫斷傷模型中，利用電穿孔法將GDNF基因轉(zhuǎn)染到RGCs層，視神經(jīng)損傷后2周及4周，能觀察到顯著RGCs保護(hù)效果，與BDNF聯(lián)合治療，效果更顯著[23]。

2.2 阻斷細(xì)胞凋亡通路 視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡是視神經(jīng)變性性疾病的共同病理基礎(chǔ)。包括內(nèi)在和外在的凋亡通路共同調(diào)控著RGCs的凋亡[24]。外在凋亡信號(hào)通路包括一系列的死亡受體家族：Fas-L、TNF-α、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體等。外在信號(hào)通路的激活能誘導(dǎo)RGCs凋亡。在青光眼病理模型中，能觀察到Fas-L、TNF-α的表達(dá)上調(diào)[25]。雖然外在信號(hào)通路在RGCs的凋亡中起到關(guān)鍵作用，但目前基因治療在這方面應(yīng)用較少。

內(nèi)在信號(hào)通路主要包括Bcl-2家族成員：促凋亡(Bax、Bad、Bid)和抗凋亡(Bcl-2、Bcl-XL)因子，共同調(diào)控著線粒體外膜的通透性，控制細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞色素C的釋放可以激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的半胱氨酸蛋白激酶(caspase)家族。因此內(nèi)在凋亡信號(hào)通路的各種因子已經(jīng)作為基因治療的靶向目標(biāo)，用來研究對(duì)RGCs保護(hù)作用。研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，在視神經(jīng)橫斷傷動(dòng)物模型中，通過基因轉(zhuǎn)染使抗凋亡基因Bcl-2或Bcl-XL過表達(dá)，能顯著提高RGCs的存活率。

最近研究證實(shí)，在成年大鼠視神經(jīng)橫斷傷模型中檢測(cè)到caspase-2在RGCs中有表達(dá)和激活，利用siRNA技術(shù)阻斷caspase-2的表達(dá)，起到顯著的神經(jīng)保護(hù)效果。有關(guān)caspase-2的研究目前正處于非動(dòng)脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變的第1期臨床試驗(yàn)階段[28]。

2.3 調(diào)控線粒體功能 長期以來，線粒體一直被公認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的能量加工廠，然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞凋亡過程中許多重要環(huán)節(jié)與線粒體的功能密切相關(guān)，包括caspase激活因子的釋放、線粒體膜電位的喪失、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變、Bcl-2家族促進(jìn)和抑制凋亡蛋白的參與等。

OPA-1是GTP酶類動(dòng)力蛋白，能穩(wěn)定線粒體的嵴結(jié)構(gòu)，減輕線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，從而減少細(xì)胞凋亡。在多數(shù)常染色體顯性遺傳的視神經(jīng)萎縮患者中，發(fā)現(xiàn)編碼OPA-1的基因出現(xiàn)突變，而OPA-1蛋白功能的喪失導(dǎo)致線粒體分裂、細(xì)胞色素C釋放、線粒體DNA損傷和增加活性氧產(chǎn)物，最終引起細(xì)胞凋亡。在DBA/2J小鼠(一種先天性基因缺陷小鼠)，通過AAV載體使OPA-1基因過表達(dá)，可以增加存活的RGCs數(shù)量，并能顯著降低活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量[29]。

腦紅蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)特異的攜氧球蛋白，與腦內(nèi)供氧密切相關(guān)，推測(cè)與線粒體之間存在著功能鏈接。Hq小鼠由于呼吸鏈復(fù)合體1的缺陷，引起RGCs的變性和視神經(jīng)萎縮。研究者通過AAV載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法使Hq小鼠腦紅蛋白過表達(dá)，腦紅蛋白能穩(wěn)定表達(dá)7個(gè)月，并無引起視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能變化，相反起到了保護(hù)RGCs和軸突的作用。提示腦紅蛋白通過修復(fù)呼吸鏈功能的缺陷，而發(fā)揮保護(hù)視覺功能的作用[30]。

Leber遺傳性視神經(jīng)病變是線粒體DNA突變引起的特征性RGCs凋亡的一種罕見疾病。ND4是線粒體DNA呼吸鏈復(fù)合物NADH脫氫酶第4亞單位區(qū)域基因。利用電穿孔基因轉(zhuǎn)染方法將野生型人類ND4亞基因轉(zhuǎn)染到Leber視神經(jīng)病變大鼠模型中，能夠起到保護(hù)RGCs的作用。在電穿孔轉(zhuǎn)染后第48天，與野生型ND4基因組相比，突變ND4基因組存活的RGCs數(shù)量下降了38%[31]。最近AAV載體介導(dǎo)的ND4(AAV-ND4)基因治療在Leber遺傳性視神經(jīng)病變第1期臨床試驗(yàn)中顯示了安全性[32]。

2.4 抑制細(xì)胞毒性作用 在青光眼的發(fā)病機(jī)制中，興奮性毒性、離子失衡、氧化應(yīng)激通過激活多種受體和通路引起RGCs的凋亡。高水平的谷氨酸過度刺激NMDA受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,產(chǎn)生過多的一氧化氮和活性氧類，導(dǎo)致細(xì)胞毒性[33]。利用NMDA受體拮抗劑,阻斷RGCs表面NMDA受體和興奮性氨基酸的結(jié)合,可以減輕低氧、興奮性毒性等對(duì)RGCs的損傷,從而達(dá)到保護(hù)效果；但NMDA受體拮抗劑美金剛在第3期臨床試驗(yàn)中失敗[34]，提示谷氨酸興奮性毒性可能存在其他途徑，包括臨近的細(xì)胞，尤其是膠質(zhì)細(xì)胞。研究[35]證明Müller細(xì)胞對(duì)谷氨酸興奮性毒性作用極其敏感，并能上調(diào)TNF-α引起RGCs凋亡。興奮性毒性的作用分子通路已被多種藥物、拮抗劑來抑制，但是基因治療在這方面還沒有被應(yīng)用。

影響細(xì)胞凋亡的其他因素是通過引起細(xì)胞離子失衡，而導(dǎo)致細(xì)胞皺縮和凋亡。研究證實(shí)，細(xì)胞皺縮發(fā)生在線粒體功能出現(xiàn)異常之前，更重要的是，細(xì)胞皺縮和凋亡伴隨著K+電流的增加以及胞內(nèi)的K+離子水平的降低。因此K+通道在RGCs凋亡過程中也起到關(guān)鍵作用。研究[36]指出，用siRNA介導(dǎo)方法去除K+通道中的kv1家族，能有效地保護(hù)RGCs。

氧化應(yīng)激由活性氧產(chǎn)物和抗氧化劑間的失衡引起，是RGCs受損和凋亡的另一重要原因。SOD2是一種抗抗氧化物歧化酶。研究[37]證明，Wistar大鼠玻璃體腔注射AAV載體表達(dá)的SOD2(AAV-SOD2)，注射后21 d進(jìn)行缺血再灌注損傷顯示，實(shí)驗(yàn)組能明顯降低超氧離子、丙二醛(MDA)、8-羥脫氧鳥苷(8-OHDG)、硝基酪氨酸水平，并能挽救RGCs和內(nèi)叢狀層受損。

3 結(jié)語

視網(wǎng)膜保護(hù)性治療對(duì)于青光眼等視神經(jīng)變性性疾病來說，顯得非常重要。在過去的十幾年中，基因治療在了解RGCs凋亡的分子機(jī)制、促進(jìn)RGCs存活和再生方面取得了巨大進(jìn)展。相關(guān)研究也從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)展到個(gè)別致盲性眼病的臨床試驗(yàn)當(dāng)中。盡管仍存在不少問題, 但它具有普通治療措施所難以達(dá)到的優(yōu)越性。基因治療是否能夠成功地應(yīng)用于青光眼或其他視神經(jīng)變性疾病的治療，除了對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)外，還有待于轉(zhuǎn)基因載體或基因轉(zhuǎn)染方法的進(jìn)一步改進(jìn), 使其降低毒副作用的同時(shí)提高轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)提高組織特異性。隨著對(duì)青光眼發(fā)病機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)的理解加深，相信基因治療在不久的未來會(huì)逐步應(yīng)用到這類疾病的治療。

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(本文編輯 諸靜英)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

莫曉芬(Email: xfmo@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.020

2015-04-27)