蝎黃解痙治哮顆粒對(duì)哮喘小鼠模型中p38MAPK和Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子變化的影響

馮曉純， 段曉征， 朱浩宇， 延光海， 鄭美珠

蝎黃解痙治哮顆粒對(duì)哮喘小鼠模型中p38MAPK和Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子變化的影響

馮曉純， 段曉征， 朱浩宇， 延光海， 鄭美珠

目的 探討蝎黃解痙治哮顆粒對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子變化的影響及其可能機(jī)制。方法 將24只6～8周齡雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、小劑量中藥組、大劑量中藥組，每組6只。制備支氣管哮喘模型，小劑量中藥組、大劑量中藥組分別給予蝎黃解痙治哮顆粒免煎制劑每日0.72、2.89 g，按20 mL/kg配制成水混勻溶液灌胃每日2次，連續(xù)10 d；正常對(duì)照組和哮喘模型組小鼠給予等量生理鹽水。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞介素4(IL-4)、IL-5、γ干擾素(IFN-γ)含量以及肺組織中磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的變化，并觀察BALF中炎癥細(xì)胞和肺組織病理學(xué)改變。結(jié)果 哮喘模型組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-4、IL-5含量水平升高和IFN-γ水平降低；肺組織中磷酸化p38MAPK表達(dá)水平升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-4、IL-5含量水平下降和IFN-γ水平升高；肺組織中磷酸化p38MAPK表達(dá)水平降低，與哮喘模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 p38MAPK可能參與了支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程。蝎黃解痙治哮顆粒對(duì)哮喘小鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制p38MAPK磷酸化、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡失調(diào)、減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。

哮喘； 蝎黃解痙治哮顆粒； p38MAPK； Th1/Th2細(xì)胞因子； 小鼠； 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

哮喘是一種病因尚不明確的復(fù)雜性疾病。在氣道炎癥發(fā)生中，T淋巴細(xì)胞占有主導(dǎo)地位[1]。在其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中，對(duì)于輔助性Th1/Th2比例失衡會(huì)誘發(fā)哮喘發(fā)作的有關(guān)研究最為多見(jiàn)。Mosmann等[2]于1986年研究發(fā)覺(jué)小鼠CD4+T細(xì)胞以因子出現(xiàn)的模式及生理功效分為：以釋放白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)和γ干擾素(interferon，IFN-γ)為主的視作Th1細(xì)胞亞群，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答；以釋放IL-4、IL-5為主的視作Th2細(xì)胞亞群，參與體液免疫應(yīng)答。有研究證實(shí)，Thl/Th2類(lèi)細(xì)胞之間失去平衡是誘發(fā)哮喘發(fā)作的主要因素之一[3]。p38MAPK作為細(xì)胞內(nèi)重要的信息傳導(dǎo)者之一，參與了多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如發(fā)病機(jī)制、炎癥、細(xì)胞凋亡等作用尤為顯著，p38MAPK或許在哮喘的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的角色[4]。而且，多種研究結(jié)果表明，p38MAPK通過(guò)作用于其下游各轉(zhuǎn)錄因子對(duì)IL-4等Th2類(lèi)細(xì)胞分泌的炎癥因子進(jìn)行的調(diào)節(jié)[5-6]。本研究通過(guò)觀察各哮喘小鼠BALF中的炎癥細(xì)胞總數(shù)、分類(lèi)及計(jì)數(shù)、肺組織病理學(xué)變化和肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)情況，分析蝎黃解痙治哮顆粒對(duì)它們的影響，為進(jìn)一步明確哮喘的發(fā)病機(jī)制和蝎黃解痙治哮顆粒的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡清潔級(jí)BALB/C雄性小鼠24只，體質(zhì)量(18±5)g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：SCXK(吉)2011-0007)。24只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、小劑量中藥組、大劑量中藥組4個(gè)組，每組6只。

1.2 藥品與試劑 卵清白蛋白、氫氧化鋁凝膠(Sigma公司)，Diff-Quick染液(碧云天生物技術(shù)研究所)，mIL-4、mIL-5檢測(cè)試劑盒(深圳市達(dá)科生物技術(shù)公司)，IFN-γ檢測(cè)試劑盒(上海基免實(shí)業(yè)有限公司)，p-p38多克隆抗體(Mybiosource公司)。XW-502B型超聲霧化器(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)，RT-2100C酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Sigma公司)；E-C電泳儀及電泳槽(美國(guó)A-C公司)；EV243電泳儀(英國(guó)柏楉)；Westernblot轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司)。

1.3 蝎黃解痙治哮顆粒藥品配制 蝎黃解痙治哮顆粒(麻黃、杏仁、苦參、白果、全蝎、甘草)由江陰天江藥業(yè)有限公司制備。小劑量按小鼠體質(zhì)量14.9 g/kg，大劑量按小鼠體質(zhì)量59.8 g/kg。

1.4 哮喘模型的建立 依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7]中記載的方法，除正常對(duì)照組外將其他組中每只小鼠腹腔注入溶于磷酸鹽緩沖液的10 μg卵清白蛋白及氫氧化鋁混合液0.5 mL處于致敏狀態(tài)。第21天開(kāi)始每日同一時(shí)間持續(xù)3 d對(duì)小鼠施以激發(fā)實(shí)驗(yàn)，使小鼠行霧化吸入，每次30 min。

1.5 給藥 實(shí)驗(yàn)第17天開(kāi)始連續(xù)給藥10 d，小、大劑量中藥組均定量定時(shí)給予蝎黃解痙治哮顆粒免煎制劑每日0.72、2.89 g，按20 mL/kg配制成水混勻溶液灌胃每日2次，連續(xù)10 d；正常對(duì)照組和哮喘模型組小鼠給予等量生理鹽水。

1.6 實(shí)驗(yàn)樣本的制備 用無(wú)水乙醚處死小鼠后，切開(kāi)小鼠的頸部皮膚，使氣管暴露，行氣管插管，1 mL注射器向氣管內(nèi)分3次緩慢注入磷酸鹽緩沖液(1 mL氯化鈉)，緩慢的抽吸回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，將灌洗液收集入EP管中，暫放置于冰中凍存，并配平以3 000 r/min，離心5 min，留上清液400～600 μL于-80 ℃凍存待用。打開(kāi)胸腔的同時(shí)分離雙肺，并提取左肺肺門(mén)中下段及左肺下葉，用生理鹽水沖洗，先后將提取的標(biāo)本放置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，使?0%甲醛固定液以4 ℃為標(biāo)準(zhǔn)將其儲(chǔ)存待用。

1.7 BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量的檢測(cè) 載玻片上涂抹的血液細(xì)胞和BALF的細(xì)胞用Diff-quik染色。取出染色后冷藏于-80 ℃冰箱中的BALF，在室溫內(nèi)平衡20～30 min，應(yīng)用ELISA Kit檢測(cè)上清液中IL-4、IL-5、IFN-γ細(xì)胞因子的含量。

1.8 肺組織磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 分別實(shí)行肺組織細(xì)胞核及肺組織細(xì)胞漿提取、蛋白含量測(cè)定、采用Western Blot檢測(cè)方法使磷酸化p38MAPK SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗、二抗實(shí)行免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，最后凝膠圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BALF中的炎癥細(xì)胞總數(shù)、分類(lèi)及計(jì)數(shù)的變化 見(jiàn)表1。

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與哮喘模型組比較，bP<0.05；與小劑量中藥組比較，cP<0.05。

表1結(jié)果表明，哮喘模型組及小、大劑量中藥組嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥細(xì)胞總數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥細(xì)胞總數(shù)均顯著低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量中藥組在降低嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥細(xì)胞總數(shù)水平上與小劑量中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量的變化 見(jiàn)表2。

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與哮喘模型組比較，bP<0.05；與小劑量中藥組比較，cP<0.05。

表2結(jié)果表明，哮喘模型組及小、大劑量中藥組BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5含量較正常對(duì)照組均顯著增多，IFN-γ含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；小、大劑量中藥組IL-4、IL-5的含量較哮喘模型組減少，IFN-γ含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量中藥組在降低小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5的含量、升高IFN-γ含量的水平上與小劑量中藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)的變化 見(jiàn)圖1。

經(jīng)Western blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)水平，見(jiàn)表3。

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與哮喘模型組比較，bP<0.05；與小劑量中藥組比較，cP<0.05。

表3結(jié)果表明，哮喘模型組及小、大劑量中藥組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)水平低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大劑量中藥組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)水平低于小劑量中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)及其組分共同作用于氣道誘發(fā)慢性炎性反應(yīng)[8]。Th1主要分泌IFN-γ及IL-2等細(xì)胞因子，與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)有關(guān)；Th2主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等炎性因子，使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE，其與各種炎癥細(xì)胞如肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞相結(jié)合，從而介導(dǎo)體液免疫，最終引起變態(tài)反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體處于正常時(shí)，Th1/Th2處于相對(duì)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到異常刺激時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2比例失衡，即Th1產(chǎn)生的IL-2、IFN-γ等因子含量減少，主要以IFN-γ含量減少為主；Th2產(chǎn)生的IL-4、IL-5及IL-13等因子含量增加，主要以IL-4、IL-5含量增多為主。其中IFN-γ可誘發(fā)Th1的分化，抑制Th2的增殖，使Th2更少的分泌炎癥因子，但當(dāng)兩者失衡時(shí)，IFN-γ含量減少，Th2分泌的炎癥因子相對(duì)增加，促使IgE生成，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，誘發(fā)哮喘發(fā)生?？梢?jiàn)，在哮喘發(fā)生中，存在Th2類(lèi)細(xì)胞因子的過(guò)分活躍，是誘發(fā)哮喘發(fā)生的重要因素。

p38MAPK通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，涉及哮喘氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性以及氣道重構(gòu)等多個(gè)方面[9-10]。p38MAPK通路是MAPK家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，主要對(duì)多種炎癥細(xì)胞因子和多種類(lèi)型的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。p38MAPK通路能夠?qū)?xì)胞內(nèi)氧化過(guò)程酶類(lèi)表達(dá)起調(diào)控作用，誘導(dǎo)黏附蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的分化和增殖過(guò)程。研究證實(shí)，各種炎性介質(zhì)的分泌及發(fā)揮均依靠磷酸化p38MAPK信息傳遞途徑。有研究已證明p38MAPK 的激活，不僅能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL-1、IL-4、IL-6、IL-8)等炎性因子，還可以介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化。應(yīng)用p38MAPK抑制劑能夠顯著抵制中性粒細(xì)胞趨化性和超氧化物產(chǎn)生、減輕炎癥反應(yīng)，P38MAPK通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化來(lái)調(diào)控Th2類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)蝎黃解痙治哮顆粒治療后，與哮喘模型組相比，小、大劑量中藥組小鼠炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及總數(shù)、IL-4及IL-5含量和肺組織中磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)均較下降，IFN-γ含量升高，提示蝎黃解痙治哮顆粒對(duì)哮喘小鼠磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，對(duì)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子平衡有正向調(diào)節(jié)作用，可減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。其對(duì)哮喘小鼠的保護(hù)作用可能與此作用密切相關(guān)。同時(shí)，雖然經(jīng)蝎黃解痙治哮顆粒大、小劑量中藥組干預(yù)后的哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞的分泌、上皮細(xì)胞的改變、IL-4及IL-5含量的改變和肺組織中磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)情況均較哮喘模型組有所顯著下降，但與正常對(duì)照組比較仍相對(duì)升高，提示可能存在沒(méi)有被蝎黃解痙治哮顆粒干預(yù)到的有某些其他機(jī)制也參與了哮喘的病變過(guò)程。因此，更深入的探索蝎黃解痙治哮顆粒的作用機(jī)制，使其得以全面的詮釋并應(yīng)用于臨床意義重大。

[1] Kay AB. Allergy and allergic diseases. First of two parts. N Engl J Med，2001，344(1):30-37.

[2] Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secretedproteins[J]. J Immunol，1986，136(7):2348-2357.

[3] 上官文姬,沈惠風(fēng).支氣管哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2009,29(5):602-606.

[4] Kampen GT, Stafford S, Adachi T,et al. Eotaxin induces degranulation and chemotaxis of eosinophils through the activation of ERK2 and p38 mitogen-activated protein kinases[J]. Blood，2000，95(6):1911-1917.

[5] Tirumurugaan KG, Jude JA, Kang BN, et al. TNF-alpha induced CD38 expression in human airway smooth muscle cells: role of MAP kinases and transcription factors NF-kappaB and AP-1[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292(6):L1385-1395.

[6] Chen CH, Zhang DH, LaPorte JM, et al.Cyclic AMP activates p38 mitogen-activated protein kinase in Th2 cells: phosphorylation of GATA-3 andstimulation of Th2 cytokine gene expression[J]. J Immunol，2000，165(10):5597-5605.

[7] Li TZ, Zhang WD, Yang GJ，et al. New flavonol glycosides and new xanthone from Polygala japonica[J]. J Asian Nat Prod Res，2006，8(5):401-409.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案)[J].中華內(nèi)科雜志,2003,42(11):817-822.

[9] Herlaar E, Brown Z. p38MAPK signalling cascades in inflammatory disease[J]. Mol Med Today，1999，5(10):439-447.

[10] 黃翠萍,楊和平,張珍祥，等.P38蛋白激酶對(duì)支氣管哮喘大鼠Th2類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控[J].中國(guó)病理生理雜志,2006,22(2):311-313.

(本文編輯：劉穎)

Effect of scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma on p38MAPK and Th1/Th2 cytokines in a mouse model of asthma

FENGXiaochun，DUANXiaozheng，ZHUHaoyu，YANGuanghai，ZHENGMeizhu.

DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，Changchun130021，China.

Objective To explore the effect of scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma on airway inflammation in asthmatic mice and Th1/Th2 type cytokines changes and its possible mechanism.Methods Totally 24 male mice of only 6 to 8 weeks old were randomly divided into four groups:normal control group, asthma model group, small-dose traditional Chinese medicine group, large-dose Chinese medicine group, 6 mice in each group. Make bronchial asthma model, and the samll-dose traditional Chinese medicine group and large-dose TCM group were given scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma to let boiled preparation, 0.72 and 2.89 g daily to make 20 mL/kg aqueous mix solution for stomach irrigation twice a day, for 10 days; normal control group and the asthma model group were given the equal amount of saline. Enzyme linked immune sorbent assay and immunoblotting were used to detect leukocyte mediated-4(IL-4), IL-5, interferon gamma(IFN-γ) content in bronchial alveolar irrigation lavage fluid (BALF) and phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase(p38MAPK) changes in the lung tissue, and the pathological changes of inflammatory cells in BALF and lung tissue were observed.Results In BALF of asthmatic model group,inflammatory cell count, IL-4 and IL-5 levels increased and IFN-γlevels decreased; in lung tissues phosphorylated p38MAPK expression level increased, and compared with the normal control group, the difference was statistically significant(P<0.05). The inflammatory cell counts, IL-4 and IL-5 levels decreased and IFN-γ levels increased, in BALF of large-dose Chinese medicine group increased; in lung tissues the phosphorylated p38MAPK expression level reduced, and compared with the asthma model group, the differences were statistically significant(P<0.05). Comparing small with large-dose TCM group, the difference was not statistically significant(P>0.05). Conclusion p38MAPK may be involved in the pathogenesis of bronchial asthma. Scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma has a protective effect on asthma in mice, and the mechanism may be related to inhibiting p38MAPK phosphorylation, regulating the imbalance of Th1/Th2 cells and reducing the inflammatory cell infiltration.

asthma; scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma; p38MAPK; Th1/Th2 cytokine; mouse； animal, experiment

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130102068JC)

130021 長(zhǎng)春，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(馮曉純，段曉征，朱浩宇)；133002 吉林 延吉，延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室(延光海)；130021 長(zhǎng)春，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(鄭美珠)

馮曉純(1960-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，教授、主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：小兒肺系疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.04.007

R-33

A

1674-3865(2015)04-0316-04

2015-04-10)