葡萄脫毒與病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

姚延興 金莉 宿福園 李長林 楊守坤 裴忺

（湖北省武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所 武漢 430065）

葡萄脫毒與病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

姚延興 金莉 宿福園 李長林 楊守坤 裴忺

（湖北省武漢市林業(yè)果樹科學(xué)研究所 武漢 430065）

葡萄（Vitisspp.）是全世界主栽果樹之一，由于其主要通過扦插和嫁接等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖，導(dǎo)致葡萄易被病毒感染,病毒在植株內(nèi)長期積累和重復(fù)感染。使得葡萄病毒病具有種類多、分布廣、危害大的特點[1]，已成為全世界關(guān)注的果樹問題之一[2]。

脫毒和病毒檢測是實現(xiàn)葡萄無毒化栽培的關(guān)鍵技術(shù)，目前常用脫毒方法有熱處理脫毒法、莖尖培養(yǎng)脫毒法和使用病毒抑制劑抗毒法，比較理想的脫毒方法是將這三種方法結(jié)合使用。

1 葡萄主要病毒病侵害的研究

1.1 葡萄扇葉病

葡萄扇葉?。℅rapevine fan leaf disease）起源于歐洲、北美的葡萄砧木，是目前研究最深入的一種葡萄病毒病，也是世界上分布最廣泛的葡萄病毒病之一。該病的病原為豇豆花葉病毒科線蟲傳多面體病毒屬病毒，主要是通過葡萄無性繁殖傳播，也可通過土壤線蟲進(jìn)行傳播。病株癥狀可表現(xiàn)為葉片呈扇子狀、黃化，成熟葉片沿主脈產(chǎn)生黃斑，葉片畸形、不對稱，葉蔓從生、矮化，葉柄凹大開張。該病導(dǎo)致果實產(chǎn)量下降，并降低果實品質(zhì)[3]。1990年代，人們對該病毒進(jìn)行了全部核酸序列測定和外殼蛋白基因的序列分析[4][5]，有效解決了該病毒在不同株系、不同品種上的癥狀表現(xiàn)差異大，難以通過癥狀進(jìn)行鑒定的難題。

1.2 葡萄卷葉病

葡萄卷葉病（Grapevine leaf roll disease）分布廣泛，所有葡萄品種皆會發(fā)生此病。該病毒的病原葡萄卷葉病毒，是長線形病毒科長線形病毒屬病毒，主要通過葡萄無性繁殖進(jìn)行傳播。卷葉病具有階段隱癥的特點，通常感病后不會立即表現(xiàn)出癥狀，生長后期才會表現(xiàn)出明顯癥狀，且癥狀因病株生長條件的不同也會表現(xiàn)出差異。主要表現(xiàn)為葉片向背面反卷，葉脈間出現(xiàn)壞死斑，病葉除葉脈外葉片變?yōu)榧t色或紅褐色，病株果穗變小，品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低[6]，該病還可導(dǎo)致葡萄果實成熟推遲，扦插難成活，抗逆性差。該病癥狀在夏末秋初尤為明顯。

1.3 葡萄栓皮病

葡萄栓皮病（Grapevine corky bark diaease）是由一種潛隱性病毒侵染而引起的病毒病，該病相關(guān)報道相對較少，病原目前尚不清楚。該病主要是通過嫁接傳播，Hewitt于1954年首次對葡萄栓皮病的癥狀進(jìn)行了描述[7]，癥狀表現(xiàn)為病株萌芽遲緩，枝蔓和樹皮產(chǎn)生裂縫，葉片變小、下卷，果實延遲成熟，品質(zhì)下降。

1.4 葡萄莖痘病

葡萄莖痘病（Grapevine stem-pittingdisease）可以通過嫁接傳播，其病原尚不清楚。據(jù)報道，通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，葡萄莖痘病毒（Grapevinestem-pitting disease）與蘋果莖痘病毒（Aapple stempitting virus）、馬鈴薯 M病毒（Potato stem-pittingvirus）和馬鈴薯X病毒（Potato X virus） 相似[8]。另有研究報道，該病可能與番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot Nepovirus） 和葡萄扇葉病毒有關(guān)。植株感染此病后春天萌芽遲，樹體生長緩慢、矮小，長勢衰弱，樹皮粗糙、木栓化，嫁接口愈合能力下降。

1.5 葡萄斑點病

葡萄斑點病（Grapevine fleck disease）是一類在大多數(shù)葡萄種上不表現(xiàn)出癥狀的病毒病，沙地葡萄是此病害較好的指示植物。該病的病原為直徑大約30nm的球狀葡萄斑點病毒。該病毒主要通過嫁接進(jìn)行傳播，對葡萄植株進(jìn)行潛伏侵染，大多數(shù)葡萄感染此病毒后，田間并不表現(xiàn)癥狀，但在沙地葡萄上癥狀表現(xiàn)明顯，感病植株的葉片會出現(xiàn)局部斑點，在三、四級小葉脈上出現(xiàn)脈明，同時出現(xiàn)葉片皺縮、扭曲并向上卷曲的癥狀，還可出現(xiàn)不同程度矮化現(xiàn)象。

2 葡萄主要脫毒技術(shù)的研究

2.1 熱處理脫毒

熱處理脫毒主要是指應(yīng)用不影響寄主植物正常生長的高溫，利用病毒在高溫下不穩(wěn)定的特點，將攜帶病毒的葡萄植株或組織器官在高溫下進(jìn)行培養(yǎng)，使病毒在高溫下鈍化、失活，達(dá)到脫毒目的，熱處理包括恒溫處理和變溫處理兩種方式，由于受到植物對高溫忍耐度的限制，單獨使用該法脫毒率較低，且高溫僅對圓形和線性病毒有效，對桿狀病毒不起作用[9]。

2.2 莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)是目前應(yīng)用最廣泛的脫毒方法之一，其脫毒原理是根據(jù)病毒粒子在植物體內(nèi)的分布不均勻，植物莖尖和根尖內(nèi)病毒含量很低或不含病毒的特點，利用莖尖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得無毒苗木。早在1960年代，人們已開始利用莖尖培養(yǎng)進(jìn)行葡萄脫毒研究[10]。莖尖大小與脫毒效果成反比，而莖尖離體培養(yǎng)再生率與莖尖大小成正比。因此，采用適當(dāng)大小的莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，是脫毒成功與否的關(guān)鍵因素。據(jù)報道，莖尖大小在 0.2～ 0.5mm之間時葡萄脫毒效果較好[11]。

2.3 化學(xué)處理脫毒

化學(xué)抑制劑主要是通過延遲或抑制病毒的復(fù)制而發(fā)揮作用的[12]。目前主要的病毒抑制劑有病毒唑、板藍(lán)根、鳥嘌呤和尿嘧啶類等多種物質(zhì)，在植物組織培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)牟《疽种苿?，可以達(dá)到脫除外植體病毒的效果。如在1980年，Cassells在馬鈴薯組織培養(yǎng)過程中，通過在培養(yǎng)基中加入病毒唑，獲得了馬鈴薯脫毒植株[13]。

目前，葡萄脫毒常用的方法就是以上 3種，但每種脫毒方法都有自身的不足。實際生產(chǎn)中，通常將幾種脫毒方法結(jié)合使用，其中應(yīng)用最廣泛的是熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合脫毒，可獲得較好的脫毒效果。

3 葡萄病毒檢測技術(shù)的研究

3.1 指示植物檢測法

指示植物檢測病毒法的原理就是利用某些植物對某些病毒的感染非常敏感，能夠很快表現(xiàn)出病征的特性來檢測植株是否帶毒，常采用汁液摩擦和嫁接傳染的方法對指示植物進(jìn)行病毒接種。該方法是常用的病毒檢測技術(shù)，具有成本低，操作簡便的優(yōu)點。在葡萄栓皮病毒和葡萄扇葉病毒的檢測中取得了很好的效果[14]，但對復(fù)合侵染或具有階段性隱性癥狀特點的病毒無法通過該法檢測。

3.2 血清學(xué)檢測法

3.3 分子生物學(xué)檢測法

分子生物學(xué)檢測是從核酸水平來檢測病毒是否存在，主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、雙鏈RNA（dsRNA）法及分子雜交法。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（IC-RT-PCR），因為比血清學(xué)方法靈敏度高，所以，分子生物學(xué)檢測法應(yīng)用更廣。

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。PCR病毒檢

由于病毒可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而這種抗體與其相應(yīng)的抗原可發(fā)生特異反應(yīng)，因此可通過已知病毒的抗血清來鑒定病毒種類，血清學(xué)方法檢測植物病毒就是利用了血清反應(yīng)的這一原理來實現(xiàn)的。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是目前應(yīng)用最多的血清學(xué)檢測法，此法主要包括雙抗體夾心法ELISA（DAS-ELISA）和 A蛋白雙抗夾心ELISA兩種，其中，DAS-ELISA在植物病毒檢測中應(yīng)用的更為廣泛。ELISA在對葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒的檢測中均獲得了很好的效果[15-16]。但是，血清學(xué)檢測法在實際應(yīng)用中存在易產(chǎn)生假陽性的缺陷，降低了其使用效率。測技術(shù)主要包括反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和IC-RT-PCR兩種。PCR技術(shù)可以對任何植物病毒基因組的少量DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再利用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測[17]。RT-PCR檢測法是利用大多數(shù)植物病毒為RNA病毒這一特點，進(jìn)行病毒檢測前，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后將cDNA進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增，用于病毒檢測分析。IC-RT-PCR法是將ELISA與RTPCR相結(jié)合進(jìn)行病毒檢測的方法。前人的研究發(fā)現(xiàn)，對葡萄病毒的檢測中，IC-RT-PCR檢測效果優(yōu)于DAS-ELISA和RT-PCR[18]。

3.3.2 雙鏈RNA法。由于絕大多數(shù)植物病毒基因組為單鏈RNA，病毒侵染植物組織后會復(fù)制、配對成具有特異性的雙鏈RNA，只要植物組織中存在病毒，就會存在與其對應(yīng)的dsRNA，因而可以利用這些dsRNA對植物組織進(jìn)行病毒檢測[19]。主要技術(shù)方法是提取感病組織中的dsRNA，然后進(jìn)行凝膠電泳分析，根據(jù)dsRNA譜帶的遷移率確定感染病毒的種類[20]。1970年代末期，dsRNA法已經(jīng)開始用于植物病毒的研究當(dāng)中[21]，到1990年代，Habili等又從感染葡萄卷葉病毒的葡萄植株中提取到三種特異性的大分子dsRNA，大小分別為19.5kb，1.9kb，0.9kb[22]。

3.3.3 分子雜交法。分子雜交法又稱為核酸探針檢測法，起源于1980年代，是利用病毒核苷酸的互補(bǔ)序列作為探針，與病毒核苷酸單鏈通過堿基配對形成雜合雙鏈，對病毒整個基因組或部分基因組進(jìn)行檢測與分析的方法。常見的雜交方法包括斑點雜交、印跡原位雜交和印跡法等。對于DNA、RNA及類病毒，均可用分子雜交法進(jìn)行檢測，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便。目前，許多種類葡萄病毒如：葡萄卷葉病毒、葡萄扇葉病毒的核酸探針都已合成且已成功用于病毒檢測[23]，其中，對葡萄扇葉病毒分子雜交檢測靈敏度已達(dá)到pg級水平[24]。

4 現(xiàn)狀及展望

目前，葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，葡萄種植面積不斷擴(kuò)大，但病毒病的危害也日益嚴(yán)重，對葡萄的品質(zhì)與產(chǎn)量都造成了嚴(yán)重影響。為了克服或降低病毒病帶來的危害，科技工作者不斷努力，各種脫毒方法也應(yīng)運而生，但葡萄脫毒效果與葡萄品種及所采用的脫毒方法都有關(guān)系。當(dāng)前實際生產(chǎn)中，任意一種脫毒方法單獨作用，效果通常無法令人滿意，通常多種脫毒方法結(jié)合使用脫毒效果較好。在脫毒效果檢測方面，指示植物法與血清學(xué)檢測法操作繁瑣，檢測結(jié)果易受假陽性干擾，使用范圍有限。分子生物學(xué)檢測法，靈敏度高，操作簡便快速，在葡萄病毒檢測方面具有巨大潛力和發(fā)展前景。

[1]劉永清，王國平.葡萄病毒病研究進(jìn)展[J].中國果樹，2002，( 4):47～51

[2]牛曉燕，牛建新，趙英.葡萄病毒病主要檢測技術(shù)[J].中國南方果樹，2005，( 2):59～61

[3]Flabertydl，Jensenfl，Kasimatisan，Grapepest management[M].Berkeley：AgricultureSciences Publications，UniversityofCalifonia.1981: 84～92

[4]Ritzenthaler C，Viry M，Pinck M，et al.Completenucleotidesequenceand genetic organization of grapevine fan leaf nepovirus RNA[J].Journal of General Virology，1991，72: 2357～2365

[5]管漢成，蔡文啟，莽克強(qiáng)等.葡萄扇葉病毒外殼蛋白基因的克隆序列分析及基在大腸桿菌中的表達(dá)[J].生物工程學(xué)報，1996，12( 2):124～128

[6]Woodham R C，Antcliff A J，Krake L R，et al.Yield differences between Sultana clones related to virus status and genetic factors [J].Vitis，1984，23:73～83

[7]Hewitt W B.Viruses and virus diseases ofgrapevine[J].California Departmentof Agriculture Bulletin，1954，(43):47～54

[8]Meng B，Zhu H Y，Gonsalves D.Rupestris stem pitting associatedvirus-1consistsofa family of sequence variants[J].Archives of Virology，1999，144(11):2071～2085

[9]尚志華.葡萄扇葉病毒脫除與檢測技術(shù)研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006

[10]DaiG H，AndaryC，Mondolot-cossonL，Boulbas D.Involvement of phenolic compounds intheresistanceof grapevinecallusto downymildew (Plasmopara viticola)[J].European Journal of Plant Pathology，1995，101: 541～547

[11]韓艷婷，石雪暉，楊國順等.紅地球葡萄GLRaV-3的莖尖培養(yǎng)脫毒及RT-PCR檢測[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27( 4):198～202

[12]De Fazio GG，Caner J，Vicente M.Inhibitory effectofvirazole(ribavirin)onthe replication of tomato white necrosis virus (VNBT)[J].Archives of Virology，1978，58:153～156

[13]Cassells A C，Long R D.The elimination of potato viruses X,Y,S and explant cultures of potato on the presence of virozole[J].Potato Research，1980，25:165～173

[14]顧沛雯，龔玉梅.三種ELISA方法檢測葡萄卷葉病毒和扇葉病毒的比較[J].中外葡萄與葡萄酒，2002，( 3):14～17

[15]蔡文啟，郭德銀，徐紹華等.葡萄扇葉病毒的分膏、鑒定、提純及血清學(xué)研究[J].植物病理學(xué)報，1990，20( 2):99～104

[16]陳建軍，李培睿，楊向英等.DAS-ELISA和PASELISA檢測GFLV的技術(shù)研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，(11):48～51

[17]張躍，鄭光明，朱新平.PCR技術(shù)新應(yīng)用與水產(chǎn)分子生物學(xué)研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1999，7 ( 2):193～200

[18]陳建軍，劉崇懷，古勤生等.DSA-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR檢測葡萄卷葉病毒Ⅲ的比較研究[J].果樹學(xué)報，2003，20( 3):173～177

[19]張麗，石磊，甘曉燕，等.葡萄脫毒培養(yǎng)與病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].北方園藝，2012，( 4):174～177

[20]牛建新，李東棟.葡萄病毒病的雙鏈RNA (dsRNA)檢測技術(shù)研究[J].果樹學(xué)報，2002，( 3): 149～152

[21]MorrisTJ，DaddsJ A.Isolation and analysis of double-stranded RNA from virusinfectedplantandfungaltissue[J].Phypathology，1979，67:854～858

[22]Habili N，F(xiàn)azeli H Z，Ewart C F A，et al.NaturalSpreadmolecularanalysisof grapevineleafroll-associatedvirus3in Australia[J].PhytoPathology，1995，85:1418～1422

[23]李東棟，牛建新，潘立忠等.葡萄卷葉病病毒雙鏈RNA提純分析研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報，2000，4 ( 3):205～210

[24]魏海生，相寧，張作芳等.用生物素標(biāo)記外殼蛋白基因cDNA探測葡萄扇葉及馬鈴薯 Y病毒[J].植物生理學(xué)報，1995，25( 4):331～334

10.139906/j.cnki.zjjgjj.1009-0584.2015.03.221

2015- 5- 8