發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

■高鵬輝 夏九龍 王志龍 武洪志 焦睿穎 王利軍 刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

在現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖中，動(dòng)物飼料添加劑仍以抗生素類為主，這些添加劑（陳代文等，2011）的使用對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用，然而，隨著人們認(rèn)識(shí)的逐漸加深，抗生素等帶來的負(fù)面效應(yīng)也越來越受到人們的關(guān)注。近幾年世界上很多國家對(duì)飼料添加劑市場(chǎng)進(jìn)行了規(guī)范，尤其在歐盟國家一些對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)有威脅的添加劑被禁用。在畜牧生產(chǎn)中，中草藥（方俊等，2004）以其種類繁多、資源豐富、療效顯著安全、不易在畜禽體內(nèi)富集、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)倍受畜牧工作者青睞。目前，多數(shù)中草藥的使用仍以煎熬為主，這種方法可使中草藥的藥效得到釋放，但并不完全。國內(nèi)外對(duì)中草藥飼料添加劑（姜天團(tuán)等，2011）的研究很多為先粉碎再添加或以液體形式投入動(dòng)物飲水中，但其缺點(diǎn)是用量大、效果不明顯。上世紀(jì)80年代，科研工作者開始了對(duì)中草藥發(fā)酵的研究，發(fā)酵作為中草藥炮制方法，能改變藥物原有性能，產(chǎn)生新的治療作用，擴(kuò)大藥用品種，微生物發(fā)酵中草藥（張高娜等，2012）是利用微生物降解作用，將中草藥中有效成分、活性物質(zhì)最大限度地釋放出來，并對(duì)中草藥活性成分進(jìn)行修飾產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，消除其自身的抗?fàn)I養(yǎng)因子。隨著發(fā)酵中草藥技術(shù)（蘭時(shí)樂等，2010）的推廣使用，在動(dòng)物生產(chǎn)中使用發(fā)酵中草藥飼料添加劑逐漸被認(rèn)可。本試驗(yàn)將最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下自制生產(chǎn)的發(fā)酵茯苓用于斷奶仔豬的生產(chǎn)中，觀察其對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響，并與抗生素作用效果相比較，為中草藥飼料添加劑替代抗生素的研究積累數(shù)據(jù)，并為本課題組中草藥復(fù)方的研究提供可靠依據(jù)，最終為畜牧行業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)一份力量。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵茯苓（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備），抗生素（桿菌肽鋅+硫酸粘桿菌素），試驗(yàn)仔豬（哈爾濱三元畜產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司）。

仔豬飼料：哈爾濱華達(dá)飼料制造有限公司。

酶聯(lián)免疫試劑盒：IgA、IgM、IgG、IL-2、IL-4、TNF-α，R&D公司。

酶標(biāo)儀、自動(dòng)洗板機(jī)、高速離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧組成

飼養(yǎng)試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取240頭28日齡體況相近（7±0.2）kg長(zhǎng)大二元雜交斷奶仔豬，分為6個(gè)處理組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭仔豬，公母各半。各處理組分別為A基礎(chǔ)日糧組，B基礎(chǔ)日糧中添加抗生素組，C基礎(chǔ)日糧中添加0.20%未發(fā)酵茯苓組，D基礎(chǔ)日糧中添加0.15%發(fā)酵茯苓組，E基礎(chǔ)日糧中添加0.20%發(fā)酵茯苓組，F(xiàn)基礎(chǔ)日糧中添加0.25%發(fā)酵茯苓組。試驗(yàn)周期為28 d。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1，參照2004年農(nóng)業(yè)部公布的豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 65-2004）。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2014年8月22日開始至2014年9月19日結(jié)束，在哈爾濱三元畜產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)期從仔豬斷奶開始至斷奶后28 d結(jié)束。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間每天8:00、11:00、14:00和17:00投料，以粉料形式投喂，飼喂量以能吃飽不剩料為度，自由飲水，每天檢查和記錄每欄仔豬的腹瀉頭數(shù)及治愈情況。驅(qū)蟲和防疫措施根據(jù)豬場(chǎng)統(tǒng)一計(jì)劃實(shí)施。

1.5 血樣采集

于斷奶仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)的第14、28 d早飼前每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4頭仔豬，前腔靜脈采血于5 ml肝素鈉管中，晃動(dòng)數(shù)秒，經(jīng)3 000 r/min離心，分離血清，分裝于0.5 ml Ep管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.6 免疫指標(biāo)測(cè)定

選取能反映斷奶仔豬免疫性能變化的免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、TNF-α）等指標(biāo)采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬免疫性能的影響。試驗(yàn)方法遵照試劑盒(購于美國R&D公司)說明書。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中ANOVA模型進(jìn)行單因子方差分析，采用LSD多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵茯苓對(duì)0～14日齡斷奶仔豬免疫功能的影響（見表2～表3）

表2 發(fā)酵茯苓對(duì)0～14日齡斷奶仔豬血液免疫球蛋白的影響

表3 發(fā)酵茯苓對(duì)0～14日齡斷奶仔豬血液細(xì)胞因子的影響

由表2可知，試驗(yàn)各組與空白對(duì)照組相比均差異顯著（P＜0.05），且均優(yōu)于空白對(duì)照組。添加抗生素組、添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液中IgA和IgG的影響差異不顯著（P＞0.05），但它們與其他各組相比均差異顯著（P＜0.05）。對(duì)IgM的影響中，添加抗生素組和添加0.20%發(fā)酵茯苓組相比差異不顯著（P＞0.05），但與添加0.25%發(fā)酵茯苓組相比均差異顯著（P＜0.05）。

由表3可知，與添加抗生素組相比，添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)TNF-α的影響差異不顯著（P＞0.05），對(duì)IL-2和IL-4的影響差異均顯著（P＜0.05）。添加發(fā)酵茯苓組與空白對(duì)照組相比，對(duì)TNF-α、IL-2和IL-4差異均顯著（P＜0.05），同時(shí)，與添加0.20%未發(fā)酵茯苓組相比差異亦顯著（P＜0.05）。

2.2 發(fā)酵茯苓對(duì)15～28日齡斷奶仔豬免疫功能的影響（見表4～表5）

表4 發(fā)酵茯苓對(duì)15～28日齡斷奶仔豬血液免疫球蛋白的影響

表5 發(fā)酵茯苓對(duì)15～28日齡斷奶仔豬血液細(xì)胞因子的影響

由表4可知，試驗(yàn)各組對(duì)斷奶仔豬血液免疫球蛋白的影響與空白對(duì)照組相比均差異顯著（P＜0.05），且均優(yōu)于空白對(duì)照組。與抗生素組相比，添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)IgA和IgG的影響差異顯著（P＜0.05），對(duì)IgM的影響優(yōu)于添加抗生素組，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。添加發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液免疫球蛋白的影響亦優(yōu)于添加未發(fā)酵茯苓組，且差異顯著（P＜0.05）。

由表5可知，添加抗生素組、添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液細(xì)胞因子的影響之間差異不顯著（P＞0.05），但與其他各試驗(yàn)組相比差異均顯著（P＜0.05）。添加發(fā)酵茯苓組與添加未發(fā)酵茯苓組相比差異顯著（P＜0.05），且優(yōu)于添加未發(fā)酵茯苓組。

2.3 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響趨勢(shì)（見圖1～圖6）

圖1 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬血液免疫球蛋白A的影響趨勢(shì)

圖2 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬血液免疫球蛋白G的影響趨勢(shì)

圖3 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬血液免疫球蛋白M的影響趨勢(shì)

圖4 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬血液腫瘤壞死因子-α的影響趨勢(shì)

圖5 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬血液白細(xì)胞介素-2的影響趨勢(shì)

圖6 發(fā)酵茯苓對(duì)斷奶仔豬血液白細(xì)胞介素-4的影響趨勢(shì)

由圖1可知，15～28日齡斷奶仔豬血液IgA含量較0～14日齡高。添加抗生素組在飼養(yǎng)的兩個(gè)階段，均優(yōu)于空白對(duì)照組和添加未發(fā)酵茯苓組。在0～14日齡階段，添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組與抗生素組對(duì)IgA的影響效果基本相同。在15～28日齡階段，添加發(fā)酵茯苓組對(duì)IgA的影響均優(yōu)于添加抗生素組，且IgA的含量有隨著發(fā)酵茯苓添加量的增加而增加的趨勢(shì)。

由圖2可知，添加抗生素組對(duì)斷奶仔豬血液中IgG含量的影響均優(yōu)于空白對(duì)照組和添加未發(fā)酵茯苓組。在0～14日齡階段，添加抗生素組對(duì)IgG含量的影響和添加0.20%及0.25%發(fā)酵茯苓組的影響效果基本相同，但在15～28日齡階段，添加抗生素組的影響效果便不及后者。添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液IgG含量影響效果基本相同。

由圖3可知，在整個(gè)飼養(yǎng)階段，添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液IgM的影響效果優(yōu)于添加抗生素組及其他試驗(yàn)各組，且斷奶仔豬血液中IgM有隨著發(fā)酵茯苓添加量增加而增加的趨勢(shì)，但在15～28日齡階段，添加0.20%發(fā)酵茯苓組與添加0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液IgM的影響效果基本相同。

由圖4可知，在整個(gè)飼養(yǎng)階段，添加抗生素組和添加0.20%及0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬TNF-α影響效果基本相同，它們均優(yōu)于其他試驗(yàn)各組。添加發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液TNF-α的影響效果優(yōu)于添加未發(fā)酵茯苓組。對(duì)比兩個(gè)飼養(yǎng)階段，各試驗(yàn)組前后TNF-α含量變化不太明顯。

由圖5可知，在0～14日齡階段，添加抗生素組對(duì)斷奶仔豬血液IL-2的影響效果優(yōu)于添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組，但在15～28日齡階段它們的影響效果基本相同。在整個(gè)飼養(yǎng)階段添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液IL-2影響效果都基本相同，且他們都優(yōu)于空白對(duì)照組和未發(fā)酵茯苓組。

由圖6可知，在0～14日齡階段，添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液IL-4的影響效果優(yōu)于添加抗生素組，且此階段斷奶仔豬血液中IL-4含量有隨著發(fā)酵茯苓添加量增加而增加的趨勢(shì)。在15～28日齡階段，添加抗生素組、添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬血液IL-4影響效果基本相同，且此階段血液中IL-4的含量較0～14日齡階段高。

3 討論

仔豬斷奶時(shí)自身免疫機(jī)能仍然很差，中草藥飼料添加劑的使用可以加強(qiáng)斷奶仔豬自身的免疫功能（丁月云等，2011）以彌補(bǔ)斷奶后仔豬免疫力低下的缺陷，從而降低斷奶仔豬的發(fā)病率和死亡率，提高養(yǎng)殖效益。中草藥茯苓（金惠等，2008）能提高斷奶豬體內(nèi)免疫球蛋白的水平，同時(shí)使巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞大量增殖，進(jìn)而使豬腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素的含量增加。研究表明，中草藥多糖（董燦娟等，2008）具有促進(jìn)細(xì)胞因子的生成的作用，茯苓多糖作為茯苓中的有效成分，亦具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能：①促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的分化增殖；②提高淋巴B細(xì)胞的功能；③刺激白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；④增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性。紀(jì)芳等（2003）將茯苓多糖進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)茯苓多糖不僅可提高動(dòng)物機(jī)體淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞殺傷活性，還可提高血清中腫瘤壞死因子的含量，改善動(dòng)物機(jī)體的免疫功能。仲兆金等（1998）發(fā)現(xiàn)三萜類成分及其衍生物對(duì)K562細(xì)胞（慢性髓樣門血病細(xì)胞）具有明顯的抑制作用，這可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體T淋巴細(xì)胞增殖分化。孔祥峰等（2009）研究表明茯苓具有促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。

本試驗(yàn)研究表明，與空白對(duì)照組相比，添加發(fā)酵茯苓、未發(fā)酵茯苓、抗生素均能提高斷奶仔豬血液中的免疫球蛋白和細(xì)胞因子含量，15～28日齡階段整體免疫因子水平較0～14日齡階段有所提高，這可能是因?yàn)樽胸i斷奶前體內(nèi)的免疫因子主要是由母乳提供，仔豬斷奶后由于機(jī)體自身免疫機(jī)制不完善體內(nèi)免疫因子數(shù)量會(huì)明顯減少，此時(shí)試驗(yàn)中添加的抗生素、未發(fā)酵茯苓、發(fā)酵茯苓能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生自身的免疫因子使動(dòng)物機(jī)體的免疫功能提高。在斷奶10日齡后，仔豬自身的免疫機(jī)制才逐步得到完善，故而此時(shí)動(dòng)物機(jī)體的免疫因子水平趨于穩(wěn)定狀態(tài)。本試驗(yàn)中，添加0.20%和0.25%發(fā)酵茯苓組對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響效果基本相同，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，認(rèn)為0.20%發(fā)酵茯苓為本試驗(yàn)的最佳添加量，此時(shí)，與空白組相比 IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-2、IL-4分別提高了31.02%、16.87%、13.42%、44.06%、53.19%、1.64%。

4 結(jié)論

發(fā)酵茯苓有增強(qiáng)斷奶仔豬免疫功能的作用，可以增強(qiáng)斷奶仔豬對(duì)疾病的抵抗能力，緩解早期斷奶所帶來的應(yīng)激效應(yīng)。其中較空白對(duì)照組IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-2、IL-4分別提高了 31.02%、16.87%、13.42%、44.06%、53.19%、1.64%。在斷奶仔豬飼料中，發(fā)酵茯苓的最佳添加量為0.20%。