響應面法優(yōu)化砂引草多糖的提取工藝

■張 欣 貝盞臨 丁春霞

(1.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021；2.沾化縣第一中學,山東濱州 256800)

砂引草（Messerschmidia Sibirica Linn.）系紫草科（Boraginaceae）紫丹屬（Tournefortia）植物，又名紫丹草、西伯利亞紫丹。砂引草為多年生宿根中旱生草本，一般4月初萌芽進行營養(yǎng)生長，5～6月開始開花，6～7月結實，種子8月下旬成熟，果后仍有一段營養(yǎng)期，9～10月逐漸干枯。根狀莖細長，斜生或匍匐，多水平分布于土表下15～20 cm處，伸展可達1～2 m，垂直根最長可達到1 m左右深處。主要分布于中國大陸及周邊北緯30°～45°相毗鄰的國家，對海拔和環(huán)境周邊要求比較低，海濱砂地、干旱荒漠、山坡道旁均有生長。砂引草屬中旱生植物，在近人棲地和草場植被中的雜草，在我國廣泛分布北方從草原到荒漠、從半濕潤到干旱地區(qū)，可生長于天然的固定、半固定的沙丘上，以及人工固定后的較平緩的沙丘上[1]，目前尚未由人工引種栽培。通常砂引草只是作為食草動物越冬所采食的牧草，據(jù)報道砂引草營養(yǎng)生長期有較高含量的粗脂肪和粗蛋白質，其中粗蛋白質種類、品質還可與紫花苜蓿媲美，有9種人體必需氨基酸的含量高于麥麩和谷類飼料及一般的禾本科牧草，此外砂引草花朵中含有芳香油的分泌細胞，香味獨特、濃郁悠長。對于砂引草的研究近年來主要集中于其泌鹽結構及對鹽漬沙質土壤改良等生態(tài)學特性的研究[2-3]，而對其多糖成分研究鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

砂引草（寧夏）、酒精（AR）、苯酚（AR）、濃硫酸（AR）、純水（15 MΩ.cm）、葡萄糖（標準品）。

1.1.2 實驗器材（見表1）

表1 試驗器材型號及生產廠家

圖1 溫度對提取率的影響

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

用UV765紫外-可見分光光度計在390～780 nm范圍內進行波譜掃描，檢測最大吸收峰波長為480 nm。以葡萄糖（標準品）測定的線性回歸方程是：C=162.6A-9.717，相關系數(shù)R2=0.997 9。

1.2.2 多糖含量與提取率的測定

采用苯酚-硫酸法[4]，精密吸取樣品溶液1.0 ml加純水稀釋定容至25.0 ml，從中精密吸取1.0 ml，置于10.0 ml容量瓶中，加純水2.0 ml、5%的苯酚溶液1.0 ml，搖勻，加入濃硫酸5.0 ml，搖勻后置于40℃水浴15 min，冷卻10 min后在波長480 nm處測定吸光度[5]，以純水做空白。多糖提取率計算公式：多糖提取率（%）=[比色液濃度（μg/ml）×比色液體積（ml）×定容體積（250.0 ml）]/[供試樣品體積（0.5 ml）×實驗樣品質量（g）×106]×100。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

溶劑提取法采用水提-醇沉法[6]。選定料液比、浸提溫度、浸提時間3個實驗因素進行試驗。先用90%的乙醇回流1.0 h，然后用蒸餾水提取多糖，選定溫度、時間、料液比3個影響因素，研究糖提取率的影響。

2.1.1 溫度對多糖提取率的影響

稱取等量砂引草5 g，分別置于8個150 ml的圓底燒瓶中，溫度梯度分別為30、40、50、60、70、80、90、100℃，將定容于80 ml的90%乙醇于80℃下回流1 h，提取1次，恒溫水浴分別為30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，料液比為1∶20，水浸提時間1.0 h。浸提溫度對砂引草多糖提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率不斷增大，在70℃前增加較為顯著，以后增加不太明顯，溫度在70、80、90℃的提取率曲線較為平緩，同時從提取的多糖溶液可以看出，隨著溫度的升高，多糖顏色加深。超過100℃多糖容易分解產生單糖而溶解在濃乙醇中影響多糖的提取率，因此選擇70～90℃作為提取的較適宜溫度，從曲線中可以看出在70℃時提取率達到了一個頂峰為2.40%。

2.1.2 料液比對多糖提取率的影響

將定容于80 ml的90%乙醇于80℃回流1 h，提取1次，固定水浸提溫度為80℃，料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，水浸提時間1 h。結果見圖2。

圖2 不同料液比對提取率的影響

由圖2可知，隨著加水量的逐漸增大，多糖提取率幾乎呈直線上升。由于提取水量的增加，則提取的多糖溶解在水中的量就越多，從而損失的多糖量就越少，相應多糖提取率就高，但增大到一定程度后，多糖提取率幾乎不變，再增加水量多糖的提取率反而降低，因此選擇料液比在1∶30左右提取率較高達到了一個頂峰為2.38%。

2.1.3 浸提時間對多糖提取率的影響

將定容于80 ml的90%乙醇于80℃回流1 h，提取1次。固定水浸提溫度為80℃，料液比1∶20，提取時間分別為1、2、3、4、5 h。結果見圖3。

圖3 時間對提取率的影響

由圖3可知，隨著加熱時間的增加，多糖提取率在2 h前增加顯著，以后增加較為平緩，增大到一定時間以后多糖提取率幾乎保持不變?？赡苡捎诩訜釙r間過長，促進多糖的溶解使得提取率增大，但是加熱時間過長提取率無明顯變化，考慮到經濟效益，提取時間選擇2～3 h為宜，3 h達到提取的達到了一個頂峰為2.44%。

2.1.4 響應面分析法優(yōu)化砂引草多糖提取工藝的研究

砂引草→乙醇熱回流→蒸餾水回流→濾液定容于250 ml容量瓶中→濾液定容25 ml容量瓶中稀釋→取出1 ml濾液與10 ml容量瓶中→加入苯酚、濃硫酸、蒸餾水→熱水中加熱15 min冷卻10 min→測OD值。采用Design-Expert軟件完成本實驗的響應面分析[7]。在完成單因素實驗后，使用軟件Design-Expert，選擇Response surface中的Box-Benhnken[8]，可以得到溫度時間等高線，溫度料液比等高線和3D曲線圖，由RSM預測最優(yōu)值，按照要求填入相應參數(shù)后預測最優(yōu)值，得出實驗結果，選出最優(yōu)提取條件。

2.2 討論

對提取溫度（T）、提取時間（t）、料液比（1∶Z）作如下變換X1=(T-70)/30，X2=(t-3)/2，X3=(Z-30)/10，以3次實驗所得多糖提取率的平均值為響應值(Y)，實驗設計與實驗結果見表2～表3。其中2、3、6、7、8實驗室用來估計實驗誤差，其他的為析因實驗。采用De?sign-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken Design(BBD)設計見表3，響應面分析處理結果見圖4～圖6。

表2 響應面實驗因素水平

表3 響應面實驗設計及數(shù)據(jù)處理

圖4 Z=f(X1，X3)的響應面與等值線

圖5 Z=f(X1，X2)的響應面與等值線

圖6 Z=f(X2，X3)的響應面與等值線

通過軟件Design-Expert 8.0.6分析，當提取溫度(T)為40 ℃、提取時間(t)為5 h、料液比(1∶Z)為1∶40 mg/ml，砂引草的多糖提取率Y為最大值2.77%。

3 結論

通過單因素實驗以及3因素3水平的響應面法實驗，建立了提取率與各影響因素之間的數(shù)學模型，依此數(shù)學模型可以預測理論提取率，并確定砂引草多糖的最佳提取工藝參數(shù)：浸提溫度40℃、浸提時間5 h、料液比1∶40，在此工藝條件下提取砂引草多糖提取率較高可達2.77%。

響應面分析法分析砂引草多糖理論提取最高值為2.77%，依據(jù)此模型提取工藝砂引草實際實驗提取率為2.75%，比理論值提取率要低0.02%。因為在實驗控制不可能達到如此精密，此外提取時間、料液比也會出現(xiàn)人為誤差，為了調整實驗因素的可操作性和便利性，將時間溫度和料液比修正為整數(shù)，所以出現(xiàn)了理論值的提取率偏差問題。但是提取率偏差不大，可操作性強實用好，能更好的為應用到往后的科研實踐中。在單因素的情況下，溫度的最高提取率為2.36%，料液比的最高提取率為2.34%，時間的最高提取率為2.42%。沒有一個單因素的提取率高過理論值，說明響應面分析的最優(yōu)值真實可靠。因此，利用響應面分析法對砂引草多糖浸提條件的優(yōu)化是可行的，得到的砂引草多糖提取條件真實可靠，具有實用價值。