復(fù)合酶與酵母聯(lián)合發(fā)酵甘草渣飼料化工藝研究

■馬彩梅 楊金鳳 顏雪琴 林祥群

（1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832000）

甘草屬豆科植物，含有100多種有效化學(xué)成分，大量應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，工業(yè)上多以提取甘草酸、甘草黃酮、多糖類物質(zhì)為目的進(jìn)行生產(chǎn)加工。加工后的固體殘?jiān)什菰１蛔鳛閺U棄物丟棄，從而造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。

為延伸甘草加工產(chǎn)業(yè)鏈，提高甘草附加值，開(kāi)發(fā)功能性飼料，本試驗(yàn)采用飼料級(jí)別的酶制劑和酵母分步接種聯(lián)合發(fā)酵甘草渣生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)粗飼料，研究確定發(fā)酵工藝最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草渣：由新疆石河子市國(guó)家經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)天德中藥廠提供。

復(fù)合酶（由含22 000 VISCO單位/g木聚糖酶和2 000 AGL單位/gβ-葡聚糖酶，以及纖維素酶、果膠酶等19種酶組合在一起的復(fù)合酶制劑），購(gòu)于北京安瑞博特生物技術(shù)有限公司。

活性生香酵母：由沂源康源生物科技有限公司贈(zèng)送。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘草渣稀酸預(yù)處理方法

取一定量的甘草渣粉，加入10倍1.5%的稀硫酸，混均，120℃處理2 h，處理完畢，用濃NaOH中和至pH值中性，過(guò)濾、干燥，再次粉碎過(guò)50目篩，做發(fā)酵底物。

1.2.2 復(fù)合酶水解甘草渣產(chǎn)糖條件選擇

稱取干燥恒重的預(yù)處理后的甘草渣1 g，加入40 ml pH值 4.8的檸檬酸緩沖溶液，調(diào)pH值到4.8，121℃滅菌30 min，加入一定量酶，在一定溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)間、pH值條件下，研究聯(lián)合發(fā)酵對(duì)產(chǎn)糖量的影響，做正交試驗(yàn)，確定最佳水解條件。

1.2.3 酵母發(fā)酵糖化后甘草渣產(chǎn)蛋白飼料條件選擇

以最優(yōu)產(chǎn)糖條件下水解的甘草渣為底物，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定以蛋白產(chǎn)量為指標(biāo)的酵母用量、溫度、發(fā)酵時(shí)間。

1.3 分析方法

① 還原糖的測(cè)定：采用DNS比色法；②蛋白質(zhì)測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法；③木質(zhì)素、纖維素、半纖維素測(cè)定：采用Van soest纖維素分析法；④水解率：水解率（%）=總還原糖質(zhì)量/甘草渣質(zhì)量（干燥恒重）×100。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘草渣主要成分測(cè)定

稱取一定量的甘草渣，采用范式纖維素分析法測(cè)定木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量；采用DNS法測(cè)定還原糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定水溶性蛋白質(zhì)的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 甘草渣原料主要成分(%)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

移取 1.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于試管中，分別加入蒸餾水至1 ml，在上述試管中分別加入DNS試劑2.0 ml，于沸水浴中加熱2 min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0 ml，搖勻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，DNS法測(cè)定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.880 3x+0.007 1，葡萄糖濃度在0.2～1.0 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

移取0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 ml于試管中，加入蒸餾水至1 ml后，在上述試管中分別加入濃度為0.1 mg/ml的考馬斯亮藍(lán)試劑5.0 ml，充分混勻，5 min后在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 DNS法測(cè)定還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程式為y=10.045x+0.009 4，可溶性蛋白質(zhì)濃度在0.01～0.08 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 復(fù)合酶水解甘草渣產(chǎn)糖條件選擇

復(fù)合酶可使甘草渣中纖維素水解生成葡萄糖。通過(guò)測(cè)定水解后溶液中還原糖的含量，計(jì)算纖維素水解率，找出最優(yōu)水解的條件組合。

2.3.1 酶用量的影響

室溫，復(fù)合酶用量為30、60、90、120、150、180 mg；水解24 h，過(guò)濾，測(cè)濾液中還原糖含量。酶用量對(duì)水解率影響結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著復(fù)合酶用量的增加，甘草渣的水解率迅速增加，當(dāng)酶用量達(dá)到120 mg時(shí)，產(chǎn)糖量達(dá)到最高，水解率達(dá)到最大；之后，隨著酶用量的增大，產(chǎn)糖量稍有下降，可能是當(dāng)糖濃度增加到一定水平時(shí)，會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制。

圖3 酶用量與水解率關(guān)系

2.3.2 時(shí)間的影響

室溫下，水解時(shí)間分別為12、14、16、18、20、22、24、26、28 h時(shí)，離心，取上層清液，測(cè)還原糖含量，計(jì)算水解率。

時(shí)間對(duì)水解率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 時(shí)間與水解率關(guān)系

由圖4可知，水解24 h時(shí)，產(chǎn)糖量最高，水解率最大，之后產(chǎn)糖量開(kāi)始下降，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增長(zhǎng)，復(fù)合酶體系產(chǎn)生副產(chǎn)物能抑制酶解反應(yīng)，消耗還原糖，從而導(dǎo)致酶解液還原糖濃度降低。

2.3.3 溫度的影響

分別在溫度為35、40、45、50、55、60 ℃條件下，水解24 h，測(cè)得溫度對(duì)水解率影響結(jié)果如圖5所示。

該次研究顯示采取激光聯(lián)合雷珠單抗治療的研究組治療有效率為91.18%，不良反應(yīng)率為11.76%，研究組在臨床治療效果和不良反應(yīng)率的比較上明顯優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。綜上，采取激光聯(lián)合雷珠單抗的方法治療增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床效果顯著，不良反應(yīng)率低，值得廣泛應(yīng)用。

在一定范圍內(nèi)，升高溫度，酶活性增加，產(chǎn)糖量增加，水解率增大。但溫度過(guò)高會(huì)抑制酶活甚至使酶失活。由圖5可知，53～55℃之間水解率較高。

圖5 溫度與水解率關(guān)系

2.3.4 搖床轉(zhuǎn)速的影響

在室溫下，搖床轉(zhuǎn)速分別為0、50、100、150、200 r/min時(shí)，對(duì)水解率影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 轉(zhuǎn)速與水解率關(guān)系

在一定搖床轉(zhuǎn)速下，酶能充分與甘草渣接觸，從而更好地水解被水解物。由圖6可知，在50 r/min下水解率較0 r/min要高，但繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速，水解率變化不大。

2.3.5 pH值的影響

室溫，pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0時(shí)，水解率如圖7所示。

pH值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)酶解離狀態(tài)產(chǎn)生影響。pH值4.5～5.0存在最大水解率。

以產(chǎn)糖量為指標(biāo)，以影響復(fù)合酶水解處理后甘草渣的主要因素：酶用量（A）、溫度（B）、pH值（C）、時(shí)間（D），進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)；轉(zhuǎn)速取50 r/min，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

圖7 pH值與水解率關(guān)系

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由表3可知，各因素影響順序?yàn)锽＞C＞D＞A，復(fù)合酶對(duì)纖維素水解產(chǎn)糖量影響最大的是溫度，最小的是酶用量，由極差值確定最佳條件組合為A2B1C3D1。即1 g甘草渣中加入120 mg復(fù)合酶、pH值5.0的緩沖溶液，于52℃、搖床轉(zhuǎn)速50 r/min下水解23 h，產(chǎn)糖量最大，水解率最高。由于正交表中無(wú)此組合，故按最佳條件組合平行補(bǔ)三組樣，測(cè)得產(chǎn)糖量為62.87 mg/g。

2.4 復(fù)合酶水解甘草渣最優(yōu)條件下接酵母產(chǎn)蛋白質(zhì)最優(yōu)條件選擇

前期樣制備：1 g甘草渣中加入120 mg復(fù)合酶、40 ml pH值 5.0的緩沖溶液，在52℃、搖床轉(zhuǎn)速50 r/min下，水解23 h后，涼至室溫。

2.4.1 酵母用量的影響

在涼至室溫的前期樣中接入 60、70、80、90、100 mg酵母。24 h后測(cè)溶液中蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)產(chǎn)量與酵母用量的關(guān)系如圖8。

圖8 酵母用量與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系

因酵母本身就是由蛋白質(zhì)組成，故隨著酵母加入量的增加，溶液中蛋白質(zhì)的含量呈上升趨勢(shì)，經(jīng)扣除因酵母加入蛋白質(zhì)含量增加的部分后，酵母加入量為90 mg時(shí)，蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)最大。

2.4.2 發(fā)酵溫度的影響

溫度分別為28、30、32、34、36 ℃時(shí)，對(duì)產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響如圖9所示。

圖9 溫度與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系

由圖9可知，酵母的生長(zhǎng)隨著溫度的升高而加快，當(dāng)溫度達(dá)到一定時(shí)，酵母活性下降，蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降。

2.4.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間分別為16、18、20、21、22、24 h，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量影響如圖10所示。

圖10 時(shí)間與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系

由圖10可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，碳源逐漸減少，當(dāng)碳源不足以維持酵母生命時(shí)，酵母開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，蛋白質(zhì)產(chǎn)量開(kāi)始下降。

2.4.4 正交試驗(yàn)

以產(chǎn)蛋白含量為指標(biāo)，以酵母用量（A）、溫度(B)、時(shí)間（C）為影響因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。前期樣制備條件同上，涼至室溫，接酵母。

表4 正交試驗(yàn)因素水平

表5 酵母發(fā)酵糖化后甘草渣產(chǎn)蛋白飼料的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由表5可知，各因素影響順序?yàn)锳＞C＞B，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量影響最大的是酵母用量，最小的是溫度，由極差值確定最佳條件組合為A3B1C2，即每1 g甘草渣制備的前期樣，接酵母100 mg、在溫度為32℃的條件下發(fā)酵21 h。在最優(yōu)工藝條件下，平行測(cè)三次。測(cè)得產(chǎn)蛋白質(zhì)平均值為1.63 mg/g。

2.5 最優(yōu)工藝下，飼料中主要成分測(cè)定

取一定量最優(yōu)條件下發(fā)酵的甘草渣，采用范式法和考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定木質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 發(fā)酵后甘草渣主要成分(%)

3 結(jié)論

①?gòu)?fù)合酶與酵母分步接種聯(lián)合發(fā)酵稀酸預(yù)處理甘草渣最優(yōu)工藝條件為：1.000 0 g甘草渣中加入120 mg復(fù)合酶、40 ml pH值5.0的緩沖溶液、溫度52℃、搖床轉(zhuǎn)速50 r/min下、水解23 h后，涼至室溫；接酵母100 mg，在溫度為32℃的條件下發(fā)酵21 h。發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)增加了2 616.7%、木質(zhì)素降低了24.2%，纖維素降低了48.43%、半纖維素降低了91.3%。

②發(fā)酵產(chǎn)物較原料蓬松，氣味酸香，能在一定程度上提高動(dòng)物的采食量。