血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子MR靶向?qū)Ρ葎┑闹苽浼捌湓谌橄侔┞闶竽Ｐ偷腗R實(shí)驗(yàn)研究＊

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像系(廣東 廣州 510515)

劉民英

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子MR靶向?qū)Ρ葎┑闹苽浼捌湓谌橄侔┞闶竽Ｐ偷腗R實(shí)驗(yàn)研究＊

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像系(廣東 廣州 510515)

劉民英

目的 制備靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體的Gd-DTPA脂質(zhì)體及其對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤的靶向性實(shí)驗(yàn)研究。方法 制備出VEGF抗體標(biāo)記的Gd-DTPA脂質(zhì)體，檢測(cè)其理化性質(zhì)。將16只乳腺癌移植瘤的裸鼠分為2組(n=8)，分別經(jīng)鼠尾靜脈注射Gd-DTPA、抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體后0.5h、2h、4h、6h、12h、24h行磁共振成像掃描，計(jì)算腫瘤強(qiáng)化值。結(jié)果 所制備的抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體具有納米顆粒的特征，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究上Gd-DTPA組強(qiáng)化峰值出現(xiàn)在0.5h，相對(duì)強(qiáng)化值為1.34±0.46；抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體組強(qiáng)化峰值均出現(xiàn)在2h，相對(duì)強(qiáng)化值為2.15±0.52。2組乳腺癌移植瘤2h、4h、8h、24h掃描時(shí)間點(diǎn)相對(duì)強(qiáng)化值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抗VEGF-Gd-DTPA組增強(qiáng)值高。結(jié)論 VEGF抗體修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體能與腫瘤體內(nèi)血管內(nèi)皮因子受體結(jié)合，為腫瘤血管生成的影像診斷提供了新的思路。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 ；磁共振； 對(duì)比劑

腫瘤是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要病因，如何提高對(duì)早期腫瘤檢出是目前分子影像學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[1]。分子影像學(xué)一直著重于研究無(wú)創(chuàng)性的影像學(xué)手段來(lái)鑒別正常細(xì)胞與異常細(xì)胞的差別，特別是希望能檢測(cè)出惡性腫瘤早期的病理特點(diǎn)，通過(guò)標(biāo)志物和結(jié)構(gòu)改變來(lái)為診療提供依據(jù)[2]。磁共振靶向?qū)Ρ葎┠軌蛞欢ǔ潭壬戏从吵瞿[瘤的生物學(xué)及病理學(xué)特征，提高疾病診斷率，還能夠?yàn)樗幬锏寞熜гu(píng)價(jià)提供依據(jù)，因此該領(lǐng)域已經(jīng)成為了分子影像學(xué)研究的熱點(diǎn)。腫瘤血管的生長(zhǎng)是病理改變的重要基礎(chǔ)，在惡性程度較高的腫瘤血管中能夠觀察到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的高度表達(dá)[3]。VEGF受體是目前重要的分子標(biāo)志物，由于只在增生血管內(nèi)表達(dá)，在正常組織內(nèi)幾乎沒(méi)有，因此檢驗(yàn)特異性高，為以VEGF受體檢驗(yàn)為基礎(chǔ)的腫瘤靶向性MRI成像研究奠定了基礎(chǔ)。本研究擬構(gòu)建一種具有親水特征在體內(nèi)具有長(zhǎng)循環(huán)特征的脂質(zhì)體將Gd-DTPA包裹于其中，并將其與VEGF抗體相連，制備VEGF抗體修飾的Gd-DTPA脂質(zhì)體，研究其對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤靶向成像效果。

1 材料與方法

1.1 材料雌性裸鼠16只，體重約20～35g；人乳腺癌細(xì)胞(MDAMB-435S)；Gd-DTPA注射液(康臣公司)；二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)(德國(guó)Lipoid公司)；親和素化-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，(美國(guó) Sigma公司)；膽固醇(廣州化學(xué)試劑有限公司)；生物素化VEGF抗體(美國(guó)NOVUS公司)；CL-2型恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng))；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；透射電鏡(日本日立公司)；Zetasizer 3000HS激光粒度分析儀(英國(guó)Malvern instruments)；Philips Achieva 3.0T MR全身磁共振成像儀。

1.2 ①按DSPG:膽固醇：DSPE-PEG2000-親和素摩爾比3:2:0.4溶入氯仿，置于恒溫磁力攪拌器攪拌約4h，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成附壁薄膜，加入TES緩沖液于超聲波清洗器中分散30min，離心取上層溶液，可得到空白的親和素-PEG脂質(zhì)體納米微粒。②取所得空白脂質(zhì)體與Gd-DTPA混合后，放入透析袋，與TES緩沖液透析72h，可形成包裹Gd-DTPA的脂質(zhì)體；③將一定比例的生物素化的VEGF抗體與Gd-DTPA脂質(zhì)體孵化形成抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體混懸液。

1.3 抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體電鏡下觀察形狀及粒徑大小取一滴空白脂質(zhì)體及抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體置于附有支撐膜的銅網(wǎng)上，靜置約5min后，用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體，用1%的磷鎢酸染色，用濾紙吸干周?chē)后w并靜置30min，之后用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.4 抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體在激光粒度分析儀檢測(cè)其流體粒徑及分散度取上述納米微粒懸濁液1ml，稀釋后置于Zetasizer 3000HS激光散射粒度分析儀中測(cè)試。

1.5 抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體包封率的測(cè)定取5ml上述懸濁液離心后所得上清液，用包封量除以加入的脂質(zhì)含量即得載藥量。

1.6 荷瘤鼠制備雌性小鼠右側(cè)乳腺皮下接種MDA-MB-435S人乳腺癌細(xì)胞懸液，待腫瘤直徑達(dá)0.8～1.5cm時(shí)，采用隨機(jī)分成2組，Gd-DTPA組、抗VEGFGd-DTPA組。MRI掃描方法：使用Philips Achieva 3.0T MR超導(dǎo)型磁共振，小鼠專(zhuān)用線(xiàn)圈內(nèi)，腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉，使用俯臥位采集T1WI圖像，掃描參數(shù)為：TR：500ms，TE：10ms，F(xiàn)OV：100×100×17mm，層數(shù)：8，層厚：2mm，層間距：0mm，NSA：2。Gd-DTPA組、抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體組分別先行T1WI冠狀位平掃，平掃后經(jīng)鼠尾靜脈分別注入Gd-DTPA、抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體，劑量為Gd-DTPA 1.25mol/ kg，注藥后30min、2h、4h、8h、24h重復(fù)掃描T1WI序列。測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)瘤體的信號(hào)值。

計(jì)算相對(duì)增強(qiáng)值：相對(duì)增強(qiáng)值=(增強(qiáng)后的信號(hào)值-增強(qiáng)前的信號(hào)值)/增強(qiáng)前的信號(hào)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料用表示，組間對(duì)比用t檢驗(yàn)，P＜0.05視為對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 空白脂質(zhì)體與抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體形態(tài)、粒徑透射電鏡下可見(jiàn)兩種脂質(zhì)體均呈類(lèi)圓形，大小較為均勻，僅有輕度聚積現(xiàn)象，抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體呈殼核結(jié)構(gòu)?？瞻字|(zhì)體的粒徑大小為(30.2±4.13)nm；抗VEGFGd-DTPA脂質(zhì)體的粒徑大小為(35.4±5.13)nm。

2.2 激光粒度分析儀測(cè)定抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體的粒徑和多分散系數(shù)分別為135nm和0.20，證明所制備納米粒徑小，分散性好。

2.3 包封率和載藥量測(cè)定按照上述方法測(cè)定抗VEGF-Gd-DTPA的包封量和載藥量，其包封量為35.2%，載藥量為49.7%。

2.4 MRI靶向成像結(jié)果2組乳腺癌移植瘤組內(nèi)比較各掃描時(shí)間點(diǎn)相對(duì)增強(qiáng)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Gd-DTPA組強(qiáng)化峰值出現(xiàn)在30min，相對(duì)增強(qiáng)值為1.34±0.46；抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體出現(xiàn)在2h，相對(duì)增強(qiáng)值為2.15±0.52。2組乳腺癌移植瘤組間比較，30min掃描時(shí)間點(diǎn)相對(duì)增強(qiáng)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Gd-DTPA組強(qiáng)化高于抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體組；2、4、8h、24h掃描時(shí)間點(diǎn)相對(duì)增強(qiáng)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體組相對(duì)增強(qiáng)值均高于Gd-DTPA組。

3 討 論

靶向診斷是利用組織細(xì)胞特異性或過(guò)度表達(dá)的分子而實(shí)現(xiàn)靶向已越來(lái)越受關(guān)注，其中，以MRI靶向成像技術(shù)是研究熱點(diǎn)[4]。從目前已有的研究來(lái)看，靶向診斷存在一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)是要攜帶足夠量的對(duì)比劑到興趣區(qū)而產(chǎn)生足夠診斷MRI信號(hào)。Unger等[5]一項(xiàng)研究就是由于聚集于腫瘤局部的靶向?qū)Ρ葎舛忍投荒墚a(chǎn)生明顯瘤體強(qiáng)化效果。本研究旨在制備靶向?qū)Ρ葎┌邢蛱囟ǖ慕M織或結(jié)構(gòu)，并利用可以容納大量釓螯合物的脂質(zhì)體，提高M(jìn)RI信號(hào)的敏感性。脂質(zhì)體作為MRI靶向?qū)Ρ葎┑膬?yōu)勢(shì)在于[6]脂質(zhì)體納米微粒循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，免疫原性較小，可以和各種配體結(jié)合，結(jié)合后不會(huì)影響其藥物代謝動(dòng)力學(xué)，所以脂質(zhì)體納米微粒是目前公認(rèn)的較好的MRI分子成像載體。由于脂質(zhì)體進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)所識(shí)別，往往難以達(dá)到靶區(qū)發(fā)揮作用，因此本次試驗(yàn)中將親水型長(zhǎng)鏈聚乙二醇(PEG)與脂質(zhì)體膜相結(jié)合，形成水化層來(lái)確保不被RES所識(shí)別和清除[7]，但由于PEG也可能與導(dǎo)向蛋白發(fā)生作用妨礙脂質(zhì)體的尋靶功能，因此本次試驗(yàn)中將VEGF受體與PEG相連，避免了PEG對(duì)靶部位的干擾。改造形成后的脂質(zhì)體不但能夠在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間滯留，更能夠主動(dòng)接近靶向的腫瘤血管，這些特性為其在機(jī)體內(nèi)尋找靶點(diǎn)提供了必要條件。本實(shí)驗(yàn)證明了其具有納米顆粒的特征，其電鏡粒徑約35.4±5.13nm，流體粒徑為135nm，達(dá)到了納米微粒的條件。根據(jù)免疫學(xué)原理，以VEGF為靶點(diǎn)，通過(guò)抗原、抗體的特異性結(jié)合特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)VEGF受體向探針靶向聚集的效果[8]。本實(shí)驗(yàn)使用的抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體經(jīng)靜脈給藥后，隨著血液可循環(huán)至腫瘤處，并與腫瘤上表達(dá)的VEGF受體結(jié)合，使得Gd-DTPA標(biāo)志到腫瘤上，使其特異性在MRI上顯影。本研究制備的抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體經(jīng)PEG修飾可以躲避活體內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞吞噬，起到長(zhǎng)循環(huán)的作用，因此可高效特異性靶向VEGF受體高表達(dá)的部位。本研究結(jié)果亦表明，由于抗VEGF-Gd-DTPA脂質(zhì)體能顯著縮短T1值，是一種T1對(duì)比劑，所以當(dāng)抗VEGF-Gd-DTPA在腫瘤組織蓄積時(shí)，可縮短其T1值，T1WI上腫瘤信號(hào)呈高信號(hào)改變；而Gd-DTPA由于其在體內(nèi)半衰期短，循環(huán)時(shí)間短，很快就通過(guò)腎臟排出體外，同時(shí)由于其是全身的血池分布，僅有少部分Gd-DTPA蓄積于腫瘤組織內(nèi)，所以其強(qiáng)化程度及強(qiáng)化時(shí)間低于靶向組。本次研究表明，利用脂質(zhì)體包裹Gd-DTPA并用PEG修飾，能有效的增加Gd-DTPA在體內(nèi)的滯留時(shí)間，并利用VEGF的抗原特性使其迅速、準(zhǔn)確的達(dá)到靶位置，為臨床腫瘤影像檢查提供了參考，為以后特異性靶向腫瘤對(duì)比劑開(kāi)拓了新的思路。

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(本文編輯: 汪兵)

Preparation of MR Contrast Agent of Vascular Endothelial Growth Factor Rectptor-targeted and its Experimental Study in MR Imaging in the Mice Model Implanted with Breast Cancer*

LIU Min-ying, Department of Medical Imaging, Nanfang Hospital Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China

Objective To prepare target Vascular Endothelial Growth Factor-Rectptor gadopentetate dimeglumine liposome and study in MR imaging in the Mice Model implanted with breast Cancer.Methods Anti-VEGF-Gd-DTPA liposome was prepared, and the physical and chemical properties were detected.The Breast cancer transplantated nude mice were divided into 2 groups (n=8). Anti-VEGF-Gd-DTPA liposome and Gd-DTPA were injected into the nude mice. After 30min, 2h, 4h, 8h, 24h, The tumor enhancement rate was calculated.Results The prepared Anti-VEGF-Gd-DTPA liposomes were characterized as nanoparticles. In vivo MRI, The group of Gd-DTPA resulted in a maximum tumor REV of 1.34±0.46 at 30min, The group of anti-VEGFGd-DTPA liposome resulted in a maximum tumor REV of 2.15±0.52 at 2h. In 2 groups of breast cancer, 2, 4, 8h，24h scan time points were compared, the difference was statistically significant (P＜0.05), the anti-VEGF-Gd-DTPA group was the highest REV.Conclusion VEGF antibody modified Gd-DTPA liposome can target the tumor vascular endothelial growth factor -receptor, which provides a new way of the tumor angiogenesis imaging diagnosis.

Vascular Endothelial Growth Factor ; Magnetic Resonance Imaging; Contrast Media

R445.2；R737.9

A

10.3969/j.issn.1672-5131.2015.12.001

劉民英

2015-11-10

【基金支持】廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2013376)