二烯丙基三硫化物對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用

過常發(fā)　孫笑天　王文碩　王春生

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科，上海　200032; 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院胸心外科，上?！?00040)

·論著·

二烯丙基三硫化物對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用

過常發(fā)1孫笑天2王文碩1王春生1

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科，上海200032; 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院胸心外科，上海200040)

摘要目的：探究以二烯丙基三硫化物為主要成分的大蒜素對心血管系統(tǒng)發(fā)揮保護作用的機制。方法： 以內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型為對象，采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK8)評價內(nèi)皮細(xì)胞活力的變化；用激光共聚焦顯微鏡測定內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的改變；將細(xì)胞接種于matrigel，觀察血管形成能力的差異。結(jié)果： 二烯丙基三硫化物在質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL時對缺氧復(fù)氧損傷的保護作用最強，其主要機制是通過減少線粒體膜電位去極化水平使內(nèi)皮細(xì)胞在經(jīng)歷缺氧復(fù)氧后仍維持正常的增殖分化能力。結(jié)論： 二烯丙基三硫化物通過線粒體途徑減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧的損傷。

關(guān)鍵詞氧化應(yīng)激；線粒體膜電位；增殖；分化

中圖分類號R329.2

文獻標(biāo)識碼

Protective Effect of Diallyl Trisulfide on Hypoxia-Reoxygenation Injury of Endothelial CellsGUOChangfa1SUNXiaotian2WANGWenshuo1WANGChunsheng1

1.DepartmentofCardiacSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China

AbstractObjective： To explore the mechanism of the protective effect of allicin, of which the main composition is diallyl trisulfide, on cardiovascular system. Methods： The endothelial cell model of hypoxia-reoxygenation injury was the research object. Vitality change of endothelial cells was evaluated by using CCK8. Confocal laser scanning microscope was used to detect the change of mitochondrial membrane potential in endothelial cells. Endothelial cells were planted onto matrigel so as to observe the difference regarding the ability of angiogenesis. Results： It showed that diallyl trisulfide performed the best protective effect at the concentration of 0.2 μg/mL, and its main mechanism based on maintaining the normal ability of proliferation and differentiation of endothelial cells after hypoxia-reoxygenation process by reducing the depolarization level of mitochondrial membrane potential. Conclusions： Diallyl trisulfide alleviates the hypoxia-reoxygenation injury of endothelial cells through the pathway involved with mitochondria.

Key WordsOxidative stress；Mitochondrial membrane potential；Proliferation；Differentiation

大蒜素及其組成成分在人體內(nèi)能夠發(fā)揮多種有益的生理作用，包括降脂、降壓、抗血栓、增強免疫以及抗腫瘤作用[1-2]。多年來，人們探索了大蒜素制備產(chǎn)物在體內(nèi)外對心血管疾病的防治作用[3]。隨著硫化氫作為體內(nèi)第三種重要氣體信號分子被發(fā)現(xiàn)，大蒜素作為該氣體分子的天然供體愈發(fā)受到重視[4]。在大蒜素的各種制備產(chǎn)物中，二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide，DATS)因其分子結(jié)構(gòu)具有3個巰基而被認(rèn)為抗氧化作用最強[5]。目前相關(guān)研究主要集中于DATS對心肌細(xì)胞的保護作用，而較少涉及其對于內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用。因此，本研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型，探索DATS對內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其機制。

1資料與方法

1.1試劑及器材新鮮臍帶取自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，過程符合醫(yī)療倫理要求。F12培養(yǎng)基、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM培養(yǎng)基)購自美國Sciencell公司。DATS、Ⅱ型膠原酶、JC-1探針購自德國Sigma公司。血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)抗體和CD31抗體購自美國Abcom公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK8)購自上海睿安生物科技有限公司。Matrigel購自美國BD公司。儀器設(shè)備：酶標(biāo)儀(日本島津公司)，共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型使用PBS將新鮮胎兒臍靜脈內(nèi)腔沖洗干凈后注入含0.1% Ⅱ型膠原酶的F12培養(yǎng)基，37℃震蕩消化15 min后收集消化液，以300×g離心5 min。去上清液后加入5 mL 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，傳代。采用免疫熒光染色法鑒定其中的vWF和CD31抗原，以評價所得內(nèi)皮細(xì)胞的純度。

將融合度為60%～70%的內(nèi)皮細(xì)胞加入含不同濃度DATS(0.1、0.2、0.3、0.4 μg/mL)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基后，放入氧氣濃度為1%的缺氧培養(yǎng)箱中靜置1 h；更換新鮮內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基后恢復(fù)正常氧濃度并培養(yǎng)2 h，建立內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。

1.3細(xì)胞活力檢測采用CCK-8評價不同濃度DATS對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用。將96孔板內(nèi)復(fù)氧2 h后的內(nèi)皮細(xì)胞每孔加入10 μL CCK8儲存液，37℃孵育1.5 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取各孔450 nm波長處的吸光度。將保護作用最大的DATS濃度處理的內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型作為DATS組，將未加DATS處理的內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型作為對照組。

1.4線粒體膜電位檢測將各組內(nèi)皮細(xì)胞消化后離心，然后用PBS重懸并加入線粒體膜電位探針JC-1至后者質(zhì)量濃度為0.1μg/mL，37℃孵育15 min后，用PBS清洗以去除未結(jié)合的多余染料，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。JC-1的單體和聚合物所發(fā)出的熒光波長分別為530 nm和630 nm，用Imagero Plus計算細(xì)胞在兩個波長處的熒光強度之比，后者代表細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化情況。

1.5體外血管形成實驗在96孔板中每孔加入50 μL Matrigel，37℃孵育45 min后，加入含不同濃度DATS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液所重懸的3×104個內(nèi)皮細(xì)胞，缺氧復(fù)氧處理后在37℃培養(yǎng)箱孵育8 h，隨后在顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1原代內(nèi)皮細(xì)胞鑒定原代細(xì)胞接種后12 h即開始貼壁，24 h形成集落，融合為單細(xì)胞層后行免疫熒光染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)所染的細(xì)胞核呈藍(lán)色，而在其周圍有CD31和vWF染色后所發(fā)出的綠色和紅色熒光(圖1)，提示該細(xì)胞內(nèi)同時存在CD31和vWF兩種內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，培養(yǎng)所得的為原代內(nèi)皮細(xì)胞。

2.2DATS減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷缺氧復(fù)氧后的內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯下降，而在缺氧復(fù)氧過程中添加DATS則可以保護內(nèi)皮細(xì)胞。DATS對于內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性，在濃度為 0.2 μg/mL 時，DATS的保護作用最強。見圖2。

2.3DATS減少線粒體膜電位損傷內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧復(fù)氧的過程中加入質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL的DATS后，在530 nm波長觀察到的綠色熒光明顯弱于對照組，而在630 nm波長觀察到的紅色熒光則明顯強于對照組(圖3)，這些結(jié)果提示，DATS可以明顯減輕缺氧復(fù)氧過程中內(nèi)皮細(xì)胞線粒體受到的損傷。

2.4DATS保護內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成能力內(nèi)皮細(xì)胞接種于matrigel并經(jīng)缺氧復(fù)氧之后，對照組的內(nèi)皮細(xì)胞彼此分離，未能形成明顯的管狀結(jié)構(gòu)；而經(jīng)DATS處理的細(xì)胞表現(xiàn)出較高的分化程度并形成管狀結(jié)構(gòu)(圖4)。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，DATS能夠在缺氧復(fù)氧處理中對內(nèi)皮細(xì)胞起到保護作用并呈現(xiàn)劑量依賴性。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，DATS發(fā)揮保護作用的機制與其減輕線粒體膜電位損傷有關(guān)。

DATS是脂溶性物質(zhì)，能夠穿透細(xì)胞膜進入胞漿，與胞漿中的谷胱甘肽反應(yīng)，生成硫化氫，而后者被認(rèn)為是DATS對于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護作用的主要物質(zhì)。硫化氫可以促使線粒體膜表面糖原合成酶激酶-3β蛋白(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的第9位色氨酸發(fā)生磷酸化，并抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放，進而減輕缺氧復(fù)氧損傷所導(dǎo)致的線粒體膜電位去極化[6]。研究[7]表明，無論是在游離線粒體還是細(xì)胞中，內(nèi)源性的硫化氫在線粒體電子運輸和氧化磷酸化過程中都起到了重要作用。另外，硫化氫穿越線粒體膜后可以減輕氧化物對線粒體DNA的損傷[8]。

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在細(xì)胞層面主要表現(xiàn)為增殖及遷徙功能低下。本實驗發(fā)現(xiàn)DATS能夠明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷缺氧復(fù)氧損傷后的體外血管形成能力。與之相一致的是，硫化氫同樣可以以劑量依賴的方式促進血管形成[9]。硫化氫可以激活ERK1/2和P38通路[10]，而這兩條通路在內(nèi)皮細(xì)胞增殖及維持自身穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。此外，硫化氫還可以通過開放KATP通道來發(fā)揮對細(xì)胞的保護作用，此種通道廣泛存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器內(nèi)[11]。

綜上所述，大蒜提取物DATS進入細(xì)胞后通過釋放硫化氫而在特定的濃度發(fā)揮抗缺氧復(fù)氧損傷的作用。這一新作用的發(fā)現(xiàn)為大蒜素應(yīng)用于移植器官保護和缺血性疾病的治療提供了依據(jù)。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：81270326)