MTT法檢測纖維蛋白膠對人脂肪源干細(xì)胞增殖的影響

黃 艷，易陽艷

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科江西南昌330006）

·基礎(chǔ)研究·

MTT法檢測纖維蛋白膠對人脂肪源干細(xì)胞增殖的影響

黃 艷，易陽艷

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科江西南昌330006）

目的：檢測纖維蛋白膠對人脂肪源干細(xì)胞增殖的影響。方法：體外培養(yǎng)人脂肪源干細(xì)胞，取第三代細(xì)胞接種到96孔板，以不同濃度（纖維蛋白與凝血酶比例：4∶1、2∶1、8∶3、5∶2）的纖維蛋白膠浸潤提取液培養(yǎng)，用MTT法檢測脂肪源干細(xì)胞在不同濃度纖維蛋白膠上的增殖情況。結(jié)果：不同濃度纖維蛋白膠制備的浸泡提取液所培養(yǎng)的人脂肪源干細(xì)胞的生長曲線無明顯差異。結(jié)論：不同濃度纖維蛋白膠對人脂肪源干細(xì)胞的增殖無明顯影響，纖維蛋白膠有望成為人脂肪源干細(xì)胞生長的支架材料。

纖維蛋白膠；人脂肪源干細(xì)胞；MTT法；組織工程

纖維蛋白膠（fibrin glue，F(xiàn)G）是一種可降解、無毒的生物蛋白制劑。對于組織工程基質(zhì)材料的選擇，目前所采用的可注射性材料有纖維蛋白膠、聚乙烯類水凝膠、聚乙烯醇-殼聚糖水凝膠、藻酸鹽類、瓊脂糖類、透明質(zhì)酸類、殼聚糖衍生物類等［1］。纖維蛋白膠因其良好的生物相容性，并能促進(jìn)細(xì)胞如干細(xì)胞的黏附與增殖，被用作多種藥物、細(xì)胞及細(xì)胞因子的緩釋載體［2-4］。脂肪源干細(xì)胞具有來源廣泛、取材不涉及倫理問題、對患者創(chuàng)傷小、細(xì)胞獲得量大、無排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，并具有多向分化的潛能［5］，是理想的組織工程種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)主要探討纖維蛋白膠作為支架對于人脂肪源干細(xì)胞（human adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）增殖的影響，為人脂肪源干細(xì)胞作為種子細(xì)胞、纖維蛋白膠作為支架材料的組織構(gòu)建研究奠定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基（含青、鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（Gibco公司，美國）、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）、胰蛋白酶（Gibco公司，美國）、MTT液、二甲基亞砜（DMSO）、纖維蛋白原（Sigma公司，美國）、凝血酶（Sigma公司，美國）。

1.2 脂肪源干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增

1.2.1 脂肪源干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：取脂肪抽吸術(shù)后的脂肪組織，組織來源于20～40歲女性患者，排除自身免疫性疾病、遺傳病及其他惡性疾病，患者知情同意。注射器負(fù)壓吸引法吸取脂肪組織20ml，PBS沖洗，去除肉眼可見的血管和纖維結(jié)締組織，無菌鑷子、剪刀剪碎脂肪；將處理好的組織移入50ml離心管，加入等體積0.075%Ⅰ型膠原酶于37℃條件下消化2h，期間不時振蕩，使脂肪與酶充分接觸；加入含15%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基終止消化；1 500rpm，5min；棄去漂浮的脂肪組織和上清，完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液；接種在10mm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，進(jìn)行第一次換液，棄原培養(yǎng)基和漂浮細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)，2～3d換液。

1.2.2 脂肪源干細(xì)胞的擴(kuò)增：待單層細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時，用PBS清洗2次，加入1:250胰蛋白酶（含EDTA）消化，當(dāng)細(xì)胞變圓并部分脫落時，加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打培養(yǎng)區(qū)域；收集細(xì)胞懸液，以1∶2～3比例傳代，2～3d換液；傳至第3代備用。

1.3 支架材料的制備

纖維蛋白膠及其浸潤提取液的制備：纖維蛋白原、凝血酶按不同比例混合（濃度4:1、濃度2:1、濃度8:3、濃度5:2），制成不同濃度的纖維蛋白膠。分別接種于96孔板中，每組各設(shè)6孔，1個主孔，5個副孔，共4組。待形成具有固定強(qiáng)度的纖維蛋白膠后加入150μl DMEM培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2孵箱內(nèi)靜置48h制備不同濃度纖維蛋白膠的浸潤提取液待用。

浸潤提取液培養(yǎng)細(xì)胞：將第3代人脂肪源干細(xì)胞制成1×103/150μl細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔加入150μl細(xì)胞懸液。每組各設(shè)6孔，1個主孔，5個副孔，共4組，另設(shè)一組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照組。放入37℃、5%CO2孵箱內(nèi)24h，待細(xì)胞貼壁；棄原培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，第一組加入纖凝比為4:1的浸潤提取液，第二組加入纖凝比為2:1的浸潤提取液，第三組加入纖凝比為8:3的浸潤提取液，第四組加入纖凝比為5:2的浸潤提取液，另設(shè)一組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組，隔天換液。重復(fù)兩次，結(jié)果行多樣本χ2檢驗(yàn)。

1.4 檢測方法

培養(yǎng)2、4、6、8、10d后，各孔加入5mg/mL MTT液體15μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后取出培養(yǎng)板，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μl DMSO，酶聯(lián)免疫檢測儀自動振搖培養(yǎng)板1min，以490nm為參考波長測定吸光度值（OD值）。

2 結(jié)果

通過酶聯(lián)免疫檢測儀測定的OD值進(jìn)行繪圖，以培養(yǎng)天數(shù)為橫軸，OD值為縱軸，繪制生長曲線。如圖（圖2）可見：實(shí)驗(yàn)組和對照組在2d內(nèi)增殖均不明顯，2d后緩慢增殖，各濃度均在第6天達(dá)生長高峰，之后出現(xiàn)生長抑制，以濃度3、4更為明顯。各濃度在第2天開始出現(xiàn)對數(shù)生長，至第6天達(dá)生長高峰。用Excel統(tǒng)計軟件包對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＞0.05，四種濃度的實(shí)驗(yàn)各組和對照組之間細(xì)胞增殖無明顯差異。

3 討論

在組織工程研究中，尋找充分發(fā)揮組織再生潛力的細(xì)胞外基質(zhì)材料是核心內(nèi)容。它要求支架具有三維立體結(jié)構(gòu)，并且具有良好的生物相容性和生物可降解性。可注射性支架是將細(xì)胞與一種具有流動性的、生物相容性好的材料復(fù)合，直接通過注射器注射到機(jī)體缺損部位，具有原位成形、操作簡單、塑形隨意、創(chuàng)傷小、不需要手術(shù)、可以減少患者痛苦與風(fēng)險等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的關(guān)注［6］。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到纖維蛋白膠由纖維蛋白原和凝血酶混合構(gòu)成膠體狀，可隨盛放容器的形狀而任意改變。Wu Han［7］等人實(shí)驗(yàn)表明凝血酶所占比例越高，膠體強(qiáng)度越大，骨髓基質(zhì)細(xì)胞在低強(qiáng)度（濃度4:1、濃度2:1）的纖維蛋白膠中細(xì)胞繁殖良好，而在高強(qiáng)度（濃度8:3、濃度5:2）的纖維蛋白膠中細(xì)胞逐漸死亡。在本實(shí)驗(yàn)中筆者得到了基本相同的結(jié)果，細(xì)胞在不同濃度的浸提液中均在第2天開始呈對數(shù)生長，第6天達(dá)生長高峰，之后出現(xiàn)生長抑制，但高強(qiáng)度（濃度8:3、濃度5:2）浸潤提取液中的細(xì)胞比低強(qiáng)度（濃度4:1、濃度2:1）浸潤提取液中細(xì)胞抑制更加明顯。實(shí)驗(yàn)中筆者采用了兩個相近濃度制備膠體，意在說明即便存在很小濃度差的纖維蛋白膠所提取的浸潤提取液培養(yǎng)脂肪源干細(xì)胞，細(xì)胞的生長狀態(tài)仍有所不同，但大體上一致，并無明顯差異。

纖維蛋白膠作為天然生物材料具有人工材料所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如生物相容性好、可降解、能促進(jìn)細(xì)胞包括干細(xì)胞的黏附與增殖［8］，它是由血漿中纖維蛋白原在凝血酶作用下降解為纖維蛋白并聚合成不溶性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)給脂肪干細(xì)胞提供了充分的生長空間及生長環(huán)境；它有良好的介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞間相互作用的功能，能刺激脂肪干細(xì)胞遷移和黏附；它良好的組織相容性和生物降解性為本實(shí)驗(yàn)提供了豐富的靶細(xì)胞環(huán)境和理想的微環(huán)境；它的可塑性和良好的材料一細(xì)胞界面，是我們選擇用纖維蛋白膠作為支架材料的重要因素。脂肪源干細(xì)胞具有體內(nèi)分布廣，取材創(chuàng)傷小，細(xì)胞獲得量大等特點(diǎn)，已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。選擇脂肪源干細(xì)胞做為本實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞是因?yàn)樗邆淅硐氲姆N子細(xì)胞的特點(diǎn)：①取材方便，對機(jī)體影響小；②體外培養(yǎng)簡便、增殖能力強(qiáng)；③能夠向特定的組織方向發(fā)育、分化；④能夠連續(xù)傳代，且傳代培養(yǎng)后不發(fā)生形態(tài)、功能的改變［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)僅為初步觀察，采用脂肪源干細(xì)胞在纖維蛋白膠表面生長、增殖的二維培養(yǎng)方法，但這種方法僅僅適用于研究細(xì)胞在體外條件下的生物學(xué)功能。下一步研究中，筆者將進(jìn)行脂肪源干細(xì)胞在纖維蛋白膠中三維培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察及生物學(xué)功能測定，并完善動物實(shí)驗(yàn)。另外仍會繼續(xù)探索如何在短時間內(nèi)獲得大量純化的自體脂肪源干細(xì)胞，加大局部脂肪源干細(xì)胞的密度，增進(jìn)脂肪源干細(xì)胞的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)可見，在不同濃度的纖維蛋白膠中脂肪源干細(xì)胞增殖良好，細(xì)胞存活率可，為可注射性的纖維蛋白膠攜帶脂肪源干細(xì)胞移植奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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MTT assay for the influence of fibrin glue on human adipose-derived stem cells proliferation

HUANG Yan，YI Yang-yan
（Department of Plastic and Cosmetic Surgery，The Second Afflicated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330000，Jiangxi，China）

Objective To examine whether the fibrin glue affects human adipose tissue-derived stem cells proliferation.Methods Human adipose tissue-derived stem cells were cultured in vitro to passage three and seeded on 96-well plate，cultured with fibrin glue in different concentration（fibrinogen/thrombin:4:1，2:1，8:3，5:2），then examine the effects on human adipose tissue-derived stem cells proliferation in different concentration by MTT assay.Results Fibrin glue in different concentration were no difference among cell growth curves of human adipose tissue-derived stem cells proliferation.Conclusion Fibrin glue in different concentration does not affect human adipose tissue-derived stem cells proliferation and may be a suitable materials as a scaffold composite with human adipose tissue-derived stem cells.

fibrin glue；human adipose tissue-derived stem cells；MTT assay；tissue engineering

R318

A

1008-6455（2015）05-0037-03

2015-01-16

2015-03-09

編輯/張惠娟

易陽艷，女，教授，主任醫(yī)師，科主任，E-mail:yyy0218@126.com