MRI示蹤超順磁性氧化鐵標(biāo)記兔脂肪干細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究

劉鍇　李春波　陳增淦　曾蒙蘇　傅彩霞　陳財(cái)忠

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院a放射科，b骨科，上?！?00032；

2. 西門(mén)子(深圳)磁共振有限公司， 深圳　518057)

MRI示蹤超順磁性氧化鐵標(biāo)記兔脂肪干細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究

劉鍇1a△李春波1b△陳增淦1b曾蒙蘇1a傅彩霞2陳財(cái)忠1a

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院a放射科，b骨科，上海200032；

2. 西門(mén)子(深圳)磁共振有限公司， 深圳518057)

摘要目的：利用磁共振成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)標(biāo)記的兔脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stemcells, ADSCs)在兔體內(nèi)的變化及其對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的進(jìn)程。方法： 用不同濃度(0、12.5、25、50、100 μg/mL)的超順SPIO標(biāo)記ADSCs。采用普魯士藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞的標(biāo)記情況，并計(jì)算細(xì)胞標(biāo)記率。用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)測(cè)定不同濃度的SPIO對(duì)細(xì)胞活性的影響。將不同濃度SPIO標(biāo)記的不同數(shù)量的ADSCs快速均勻地重懸于盛有1%瓊脂糖的冷凍管中進(jìn)行體外MRI成像，測(cè)量T2*圖像信號(hào)強(qiáng)度。將50 μg/mL的SPIO標(biāo)記的ADSCs接種至聚乳酸-羥基乙酸共聚酶[Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA]支架材料后，回植入兔(n=5)膝關(guān)節(jié)軟骨直徑為3 mm的軟骨缺損處，分別于術(shù)后1、4、8和12周進(jìn)行MRI T2*序列動(dòng)態(tài)掃描，監(jiān)測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)的變化及關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)情況。結(jié)果： 原代培養(yǎng)的ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣外觀，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞呈聚集樣生長(zhǎng)。普魯士藍(lán)染色見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明顯的藍(lán)色致密顆粒，隨著SPIO濃度的升高，藍(lán)色致密顆粒增多；當(dāng)SPIO的濃度≥50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的標(biāo)記率可達(dá)100%。CCK-8檢測(cè)顯示，SPIO的濃度越高，細(xì)胞的活性越低，當(dāng)SPIO的濃度大于50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的活性明顯降低(P<0.05)。體內(nèi)MRI顯示，術(shù)后1周和4周可見(jiàn)顆粒狀低信號(hào)區(qū)域，信號(hào)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。術(shù)后8周，顆粒狀低信號(hào)范圍逐漸縮小，信號(hào)強(qiáng)度接近周?chē)M織，說(shuō)明SPIO標(biāo)記的ADSCs在動(dòng)物體內(nèi)存活良好，并正常分裂增殖，形成正常關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)。結(jié)論： MRI聯(lián)合SPIO可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的分布、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)歸，有望作為一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損效果的方法。

關(guān)鍵詞磁共振；脂肪干細(xì)胞；超順磁性氧化鐵；細(xì)胞示蹤

中圖分類(lèi)號(hào)R684

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

MRI Tranking of Superparamagnetic Iron Oxide-Labeled Rabbit Adipose-Derived Stem Cells for Treatment of Carticular Carilage DefectLIUKai1a△LIChunbo1b△CHENZenggan1bZENGMengsu1aFUCaixia2CHENCaizhong1a

1.aDepartmentofRadiology,bDepartmentofOrthopedics,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.SiemensShenzhenMagneticResonanceLtd.,Shenzhen518057,China

AbstractObjective： To detect dynamically in vivo superparamagnetic iron oxide-labeled rabbit adipose-derived stem cells (ADSCs) for treatment of carticular cartilage defect with MRI tracking technique. Methods： Rabbit ADSCs were firstly labeled with different concentrations of SPIO (0 μg/mL,12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, and 100 μg/mL). The labeled ADSCs were stained with Prussian blue and the labeling rates were calculated. The activities of different concentration SPIO-labeled ADSCs were determined by CCK-8. Different amounts of different concentration SPIO-labeled ADSCs were dissolved homogeneously in cryovial with 1% agarose and T2*-weighted MRI was used to evaluate their signal intensity in vitro. Then 50 μg/mL SPIO-labeled ADSCs and unlabeled ADSCs were seeded in PLGA [Poly (lactic-co-glycolic acid)] scaffold, respectively. Following that, the cells-PLGA scaffold compounds were implanted in the rabbit (n=5) articular cartilage defect with average diameter 3 mm. At 1, 4, 8, and 12 weeks post-operatively, the change of implanted-ADSCs and the repain of articular cartilage defect were dynamically detected by T2*-weighted MRI. Results： Primarily cultured rabbit ADSCs presented fibroblast-like appearance, and ADSCs proliferated with aggregations after 7 days. Prussian blue staining showed amount of blue dense granules in cytoplasm. With the increasing of SPIO concentration, the count and region of blue dense granules increased. When SPIO concentration reached 50 μg/mL, the labeling rate of ADSCs reached 100%. The measure of CCK-8 showed that the activities of ADSCs decreased with the increasing of SPIO concentration. When the SPIO concentration was greater than 50 μg/mL, the activities of ADSCs were obvious low (P<0.05). In vivo, MRI showed postoperative 1 week and 4 weeks visible granules with low signal area, and the signal strength was significantly lower than the control group. Until 8 weeks post-surgery, granules with low signal area gradually narrowed and signal strength was similar to the control group. SPIO-labeled ADSCs lived with a normal division growth and performed normal cartilage articular. Conclusions： MRI combined SPIO is a potential method to dynamically detect the distribution, growth and prognosis of cells in the body, and can also be used to determine the respiration of articular cartilage defect.

Key WordsMagnetic resonance imaging；Adipose-derived stem cells;Superparamanetic iron;Cell tracking

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一類(lèi)來(lái)源于脂肪組織、具有自我更新及多向分化能力的成體間充質(zhì)干細(xì)胞。在特定的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，ADSCs可以向心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)元和軟骨細(xì)胞等終末細(xì)胞分化，在疾病治療和再生醫(yī)學(xué)方面具有潛在的研究及應(yīng)用價(jià)值[1-5]。近年來(lái)，干細(xì)胞移植技術(shù)的研究主要集中于干細(xì)胞植入機(jī)體后的細(xì)胞分布、分化、增殖及轉(zhuǎn)歸等生物學(xué)行為。但是，如何無(wú)創(chuàng)地監(jiān)測(cè)植入細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的生存遷徙情況一直困擾著臨床。超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是一類(lèi)MRI陰性對(duì)比劑[6-7]，它的有效成分是Fe3O4晶體核心，被包以葡聚糖生物高分子物質(zhì)，構(gòu)成核殼結(jié)構(gòu)。包覆后的SPIO具有一定的超順磁性，能明顯縮短組織的T2值。本研究通過(guò)對(duì)兔ADSCs進(jìn)行不同濃度的SPIO標(biāo)記，研究SPIO對(duì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，并觀察特定濃度SPIO的體外和體內(nèi)MRI成像效果，為干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1材料成年新西蘭大白兔10只，體質(zhì)量約1.8 kg(購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自澳大利亞JRH公司；L-谷氨酰胺(300 g/mL)、SPIO、 胰蛋白酶、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)PLGA]支架材料購(gòu)自上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸(50 g/mL)、氯仿、氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；青霉素(0.062 5 g/L)、鏈霉素 (100 g/L)購(gòu)自石家莊華北制藥有限公司；I型膠原酶購(gòu)自美國(guó)sigma公司。

1.2兔ADSCs的分離和培養(yǎng)ADSCs的培養(yǎng)參照我們以往的研究[8]，具體步驟為：成年大白兔麻醉后，取腹股溝處皮下脂肪組織，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的顆粒，置于相等體積、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.075%的I型膠原酶中，37℃恒溫?cái)嚢柘?0 min。取等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(低糖DMEM、10% FBS、100 g/L鏈霉素、0.062 5 g/L青霉素)中和后，重新懸浮并離心(2000 r/min，10 min)。棄去上層的脂肪細(xì)胞、脂滴和液體，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將混懸液體加入培養(yǎng)皿，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代備用。

1.3SPIO標(biāo)記ADSCs將經(jīng)高溫滅菌處理的SPIO加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配成濃度分別為100、50、25和12.5 μg/mL的SPIO混合液，未加入SPIO的培養(yǎng)基定義為 0 μg/mL。待上述第三代ADSCs長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底面積的85%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，PBS充分沖洗2次后，加入含不同濃度SPIO的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入未標(biāo)記的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.4普魯士藍(lán)染色及標(biāo)記率計(jì)算選擇不同濃度SPIO標(biāo)記的ADSCs，棄去原培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS沖洗3次，加入4%的多聚甲醛溶液固定15 min，水洗3次。加入普魯士藍(lán)(2% 亞鐵氫化鉀和2% 鹽酸的體積比為1∶1)孵育30 min，水洗。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算鐵染陽(yáng)性率。

1.5不同濃度SPIO對(duì)ADSCs生物活性影響的檢測(cè)將ADSCs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。然后將板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細(xì)胞標(biāo)記參照上述方法，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，將含不同濃度SIPO的培養(yǎng)基分別加入不同的孔中，每組6孔。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入CCK-8試劑，每孔10 μL，混合均勻，于37℃恒溫箱避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的熒光強(qiáng)度。將未標(biāo)記的ADSCs作為對(duì)照，計(jì)算ADSCs的活性。

1.6標(biāo)記細(xì)胞的體外MRI成像將各濃度SPIO標(biāo)記的ADSCs快速均勻地重懸于盛有1%的瓊脂糖的冷凍管中(細(xì)胞密度分別為1×107個(gè)/mL、0.5×107個(gè)/mL、1×106個(gè)/mL、0.5×106個(gè)/mL)，每組3個(gè)樣本。待瓊脂冷卻凝固后，進(jìn)行MRI掃描。應(yīng)用3.0T MR機(jī)，實(shí)驗(yàn)專(zhuān)用線圈，采用梯度回波T2*序列。成像參數(shù)：掃描野(FOV)為120 mm×120 mm，重復(fù)時(shí)間(TR) 445.00 ms，回波時(shí)間(TE) 4.36 ms，矩陣256×256，層厚2 mm，層間距0.6 mm，翻轉(zhuǎn)角60°，帶寬 228Hz/像素， 激勵(lì)次數(shù)2.0。測(cè)量每個(gè)樣本的信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度確定不同SPIO濃度及細(xì)胞數(shù)量對(duì)T2*WI圖像的影響。

1.7細(xì)胞支架材料復(fù)合物的制備細(xì)胞支架材料復(fù)合物的制備根據(jù)我們以前的方法[8]，具體制備步驟為：將第3～5代50 μg/mL SPIO標(biāo)記的ADSCs用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化后，收集細(xì)胞于50 mL離心管，2000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)，配制成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，用微量移液槍將細(xì)胞接種于滅菌的PLGA支架材料。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基。24 h后，把細(xì)胞支架材料復(fù)合物移至6孔板。用同樣的方法制備未標(biāo)記的ADSCs支架材料復(fù)合物。

1.8兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的制備取健康西蘭兔5只，將其放置于動(dòng)物臺(tái)上，用氯胺酮(1 mg/kg)經(jīng)肌內(nèi)注射麻醉后，固定、備皮、常規(guī)消毒鋪巾。于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作縱行切口，逐層切開(kāi)關(guān)節(jié)腔，將髕骨推向外側(cè)，暴露雙側(cè)髕股的關(guān)節(jié)面(圖1A)。于股骨滑車(chē)關(guān)節(jié)面處用直徑為3 mm的鉆頭鉆孔，造成軟骨全層缺損(圖1B)。完全去除組織碎屑和血塊后暴露缺損，左肢植入SPIO標(biāo)記的ADSCs支架材料復(fù)合物(實(shí)驗(yàn)組，n=5)，右肢植入未標(biāo)記的ADSCs支架材料復(fù)合物(對(duì)照組，n=5)，見(jiàn)圖1C。分層縫合膝關(guān)節(jié)囊、組織、皮膚。

A：充分暴露髕骨關(guān)節(jié)面；B：關(guān)節(jié)面正中以3 mm為直徑鉆孔，去除組織碎屑，充分暴露缺損；C：充分填充ADSC支架材料復(fù)合物

圖1兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的制作過(guò)程

1.9標(biāo)記細(xì)胞的體內(nèi)MRI成像干細(xì)胞支架材料移植后第1、4、8和12周，分別行兔膝MRI檢查。應(yīng)用德國(guó)Siemens verio 3.0T超導(dǎo)磁共振掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)專(zhuān)用線圈。用前述方法將兔麻醉后取仰臥位，分別固定雙前肢和雙后肢行MRI成像，將膝關(guān)節(jié)缺損局部置于線圈中心部位。T2*序列：FOV為140 mm×140 mm，TR 445.00 ms，TE 4.36 ms，矩陣320×320，層厚2 mm，層間距0.4 mm,帶寬228Hz/pixel，激勵(lì)次數(shù)7.0； 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI TR 4500 ms，TE 100 ms，翻轉(zhuǎn)角30°，激勵(lì)次數(shù)2.0。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行多樣本方差分析，比較不同濃度SPIO對(duì)ADSCs的標(biāo)記率及細(xì)胞活性的影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兔ADSCs的形態(tài)觀察ADSCs培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)散在少量的貼壁細(xì)胞，以短梭形細(xì)胞為主，部分呈三角形或不規(guī)則形(圖2A)。72 h后，可見(jiàn)較多的梭形貼壁細(xì)胞，分裂增殖速度快，增生為形態(tài)相對(duì)均一的成纖維樣梭形細(xì)胞。7 d后，80%～90%細(xì)胞融合，并呈束狀、菊花狀或旋渦狀排列。傳代至第3代，可見(jiàn)ADSCs呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一(圖2B)。

A：原代ADSCs培養(yǎng)24 h后；B：第3代ADSCs培養(yǎng)72 h后

圖2倒置顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)

2.2SPIO標(biāo)記ADSCs情況SPIO標(biāo)記的ADSCs呈普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色致密顆粒分布。隨著SPIO濃度的增加，藍(lán)色致密顆粒顏色加深。而未標(biāo)記SPIO的ADSCs細(xì)胞質(zhì)中未見(jiàn)藍(lán)色顆粒物質(zhì)。顯微鏡下觀察藍(lán)染ADSCs并計(jì)算陽(yáng)性率。當(dāng)SPIO的濃度≥50 μg/mL時(shí)，標(biāo)記24 h后，陽(yáng)性率幾乎達(dá)100%(圖3A～B)；當(dāng)SPIO的濃度<50 μg/mL時(shí)，標(biāo)記24 h后，隨著SPIO濃度的降低，標(biāo)記率也顯著下降(圖3C～E)。不同濃度SPIO對(duì)ADSCs的標(biāo)記率見(jiàn)圖4A。

A～E分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和0 μg/mL的SPIO標(biāo)記的ADSCs

圖3普魯士藍(lán)染色顯示SPIO標(biāo)記的ADSCs

2.3SPIO對(duì)ADSCs生物活性的影響用CCK法檢測(cè)不同濃度SPIO標(biāo)記的ADSCs的活性。當(dāng)SPIO的濃度為12.5、25、50 μg/mL時(shí)，與未標(biāo)記SPIO(0 μg/mL)的ADSCs相比，活細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)SPIO的濃度為100 μg/mL時(shí)，活細(xì)胞率較SPIO濃度為50 μg/mL時(shí)顯著減少。這些結(jié)果表明，低濃度的SPIO(≤50 μg/mL)對(duì)ADSCs的活性沒(méi)有明顯影響；但是當(dāng)SPIO的濃度大于50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低。見(jiàn)圖4B。

注：與50 μg/mL 相比，*P<0.05； A：不同濃度SPIO的細(xì)胞標(biāo)記率；B：不同濃度SPIO對(duì)ADSCs活性的影響

圖4不同濃度SPIO的ADSCs標(biāo)記率及

2.4SPIO標(biāo)記ADSCs的體外信號(hào)特征不同濃度SPIO標(biāo)記的ADSCs培養(yǎng)24 h后，在T2*加權(quán)MRI掃描圖像上，可見(jiàn)SPIO的濃度及細(xì)胞的數(shù)量均會(huì)影響MRI信號(hào)強(qiáng)度。在SPIO濃度一定的條件下，隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，MRI信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低；在細(xì)胞數(shù)量一定的條件下，隨著SPIO濃度的增加，MRI信號(hào)強(qiáng)度逐漸減低。見(jiàn)圖5。

A：T2*加權(quán)MRI圖像；B：T2*序列MRI信號(hào)強(qiáng)度變化

圖5不同濃度SPIO標(biāo)記的不同數(shù)量ADSCs的體外信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)ADSCs活性的影響

2.5SPIO標(biāo)記ADSCs的MRI體內(nèi)成像關(guān)節(jié)軟骨損傷模型制作成功后，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨缺損處出現(xiàn)彌漫性顆粒狀異常低信號(hào)改變；術(shù)后4 周見(jiàn)軟骨缺損部位低信號(hào)范圍擴(kuò)大，但隨著支架植入時(shí)間的延長(zhǎng)，信號(hào)減低程度逐漸減輕；術(shù)后8周和12周軟骨缺損處信號(hào)減低程度明顯減弱，范圍亦明顯縮小，信號(hào)強(qiáng)度類(lèi)似于周?chē)M織。對(duì)照組于術(shù)后1周、4周、8周和12周未見(jiàn)信號(hào)強(qiáng)度的明顯變化。見(jiàn)圖6。

A1～A4：植入50 μg/mL SPIO標(biāo)記的ADSCs支架材料復(fù)合物后，第1、4、8和12周MRI圖像；B1～B4: 植入未標(biāo)記SPIO的ADSCs支架材料復(fù)合物后，第1、4、8和12周的MRI圖像；C：正常兔膝關(guān)節(jié)MRI圖像；D：細(xì)胞支架材料植入體內(nèi)后，MRI信號(hào)強(qiáng)度的變化

圖6SPIO標(biāo)記ADSCs修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的MRI體內(nèi)成像

3討論

軟骨組織是由多糖和膠原組成的乏血管組織。軟骨組織損傷修復(fù)的過(guò)程復(fù)雜，已是臨床的難題之一。組織工程的出現(xiàn)為軟骨損傷的修復(fù)提供了新的方法，其中，獲得理想的種子細(xì)胞是其最核心的環(huán)節(jié)[1-3]。2004年，Zuk等[9]首次從脂肪組織中分離培養(yǎng)出具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。大量的研究證實(shí)了來(lái)自于脂肪組織的MSCs表現(xiàn)出與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)類(lèi)似的增殖分化能力。體外培養(yǎng)的ADSCs在不同的誘導(dǎo)條件下，不但能夠向脂肪、軟骨、骨、肌肉等中胚層細(xì)胞系分化[5, 8-10]，而且能夠向神經(jīng)、內(nèi)皮、心肌等其他胚層細(xì)胞系分化[11-13]。體外培養(yǎng)的ADSCs植入機(jī)體后能分化形成特定的組織，在組織損傷的修復(fù)與重建方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。但是，應(yīng)用組織工程的方法重建組織缺損涉及到一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題，即如何動(dòng)態(tài)地評(píng)估干細(xì)胞等移植物在活體中的存活、分布、遷移、轉(zhuǎn)歸等過(guò)程。目前，大多數(shù)用于鑒定干細(xì)胞體內(nèi)存活的方法均需要在植入后的一定時(shí)間內(nèi)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此，探索一種有效的無(wú)創(chuàng)方法對(duì)植入的種子細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤和監(jiān)測(cè)，顯得非常重要。本研究選擇具有高度增殖及分化潛能的ADSCs來(lái)重建兔關(guān)節(jié)軟骨的缺損，同時(shí)結(jié)合MRI技術(shù)來(lái)評(píng)估ADSCs在體內(nèi)的生存、遷徙情況。

SPIO是一種由葡聚糖生物高分子包裹Fe3O4晶體形成的呈核殼式結(jié)構(gòu)的磁標(biāo)記探針，其可明顯縮短MRI T2值，降低組織的信號(hào)強(qiáng)度[6-7]。當(dāng)標(biāo)記ADSCs時(shí)，細(xì)胞團(tuán)可因吞噬鐵顆粒而呈現(xiàn)明顯的低信號(hào)，可以間接地反應(yīng)移植物的分布及聚集情況[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SPIO標(biāo)記ADSCs來(lái)檢測(cè)磁性材料對(duì)細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，隨著SPIO濃度的增加，細(xì)胞的標(biāo)記率增高，當(dāng)SPIO的濃度為50 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞的標(biāo)記率可達(dá)100%；但是隨著SPIO濃度的增加，細(xì)胞的活性逐漸下降，壞死細(xì)胞的數(shù)量增多，SPIO濃度≤50 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性的影響則不明顯。Arbab等[15]的研究亦顯示，濃度為25～50 μg/mL的SPIO對(duì)細(xì)胞的有效標(biāo)記率最高，同時(shí)不影響細(xì)胞的生存、增殖能力及活性。體外MRI顯示，標(biāo)記細(xì)胞的SPIO濃度和細(xì)胞數(shù)量均會(huì)影響MRI的信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)SPIO的濃度<25 μg/mL時(shí)，單純?cè)黾蛹?xì)胞的數(shù)量不明顯影響MRI的信號(hào)強(qiáng)度。我們推測(cè)，可能由于細(xì)胞的標(biāo)記率太低，即使細(xì)胞的數(shù)量增加了，但是標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量并沒(méi)有明顯增加，因此MRI信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)隨之改變。當(dāng)SPIO的濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，MRI信號(hào)強(qiáng)度明顯減低。因此，我們認(rèn)為，SPIO的濃度為50 μg/mL時(shí)，既可以獲得較高的細(xì)胞標(biāo)記率，同時(shí)不影響細(xì)胞活性，還可以產(chǎn)生隨著細(xì)胞數(shù)量變化的MRI信號(hào)變化趨勢(shì)，這對(duì)于評(píng)價(jià)細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。

組織工程技術(shù)的不斷進(jìn)步為軟骨損傷的修復(fù)重建開(kāi)辟了一條新的途徑[16]。本研究采用濃度為50 μg/mL的SPIO標(biāo)記兔ADSCs，并種植于PLGA支架材料來(lái)修復(fù)兔的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。MRI顯示，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周軟骨缺損處出現(xiàn)明顯的低信號(hào)影像；術(shù)后4周，低信號(hào)強(qiáng)度較前明顯減弱，低信號(hào)范圍明顯縮小；術(shù)后8周和12周，低信號(hào)消失，信號(hào)強(qiáng)度類(lèi)似于周?chē)能浌墙M織，說(shuō)明植入ADSCs支架材料復(fù)合物可以修復(fù)兔的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。但是植入未標(biāo)記SPIO的ADSCs支架材料復(fù)合物的對(duì)照組的MRI 信號(hào)強(qiáng)度自術(shù)后1周到12周沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。為了進(jìn)一步評(píng)估ADSCs支架材料復(fù)合物的體內(nèi)情況，我們定量測(cè)定了細(xì)胞支架材料的MRI信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周的MRI信號(hào)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組和正常組；術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組的信號(hào)強(qiáng)度逐漸升高，較術(shù)后1周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組的信號(hào)強(qiáng)度升高到接近對(duì)照組和正常組。ADSCs吞噬的SPIO在體內(nèi)逐漸代謝，可能涉及以下兩個(gè)方面：(1)由于ADSCs在體內(nèi)的分裂增殖，子代中的總鐵含量降低；(2)干細(xì)胞凋亡或裂解，游離的鐵離子會(huì)被周?chē)奘杉?xì)胞吞噬。因此，局部干細(xì)胞SPIO產(chǎn)生的信號(hào)逐漸減弱。盡管這種代謝過(guò)程可能會(huì)影響MRI信號(hào)強(qiáng)度，而巨噬細(xì)胞吞噬磁性材料后游走、遷徙，在早期即可以改變MRI的信號(hào)強(qiáng)度，但對(duì)于干細(xì)胞的原位分裂、分化來(lái)說(shuō)，這個(gè)過(guò)程相對(duì)緩慢。本研究證實(shí)，ADSCs支架材料復(fù)合物植入體內(nèi)后，MRI的信號(hào)強(qiáng)度變化是一個(gè)逐漸減低的過(guò)程，8周后接近于對(duì)照組，說(shuō)明ADSCs在體內(nèi)增殖、分化良好，且沒(méi)有發(fā)生明顯的凋亡。因此，我們認(rèn)為，利用3T MRI動(dòng)態(tài)示蹤SPIO標(biāo)記的細(xì)胞，可較好地顯示移植細(xì)胞在活體內(nèi)的分布和遷徙，有望成為無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、直觀的組織工程種子細(xì)胞示蹤方法。

綜上所述，本研究通過(guò)用不同濃度的SPIO體外標(biāo)記ADSCs，證實(shí)低濃度的SPIO不會(huì)影響細(xì)胞的活力和增殖等生物學(xué)行為，與研究[17]的結(jié)果一致；體外及體內(nèi)MRI掃描示，50 μg/mL的SPIO標(biāo)記細(xì)胞可有效地顯示細(xì)胞在體內(nèi)的生存和轉(zhuǎn)歸情況。盡管SPIO在MRI中的應(yīng)用極大地促進(jìn)了細(xì)胞示蹤及細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，為組織工程的臨床應(yīng)用提供了更多客觀、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，但是，目前MRI示蹤干細(xì)胞仍有很多的不足，如標(biāo)志物是否影響干細(xì)胞的遠(yuǎn)期安全性、標(biāo)志物是否影響干細(xì)胞在體內(nèi)分化的轉(zhuǎn)歸、標(biāo)志物在體內(nèi)的代謝方向如何等。因此，在以后的研究中，需要通過(guò)提高M(jìn)RI技術(shù)及改善標(biāo)志物的理化性質(zhì)等來(lái)進(jìn)一步研究干細(xì)胞在體內(nèi)的遷徙、分化和轉(zhuǎn)歸的進(jìn)程。

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通訊作者陳財(cái)忠，E-mail:chen.caizhong@zs-hospital.sh.cn

△劉鍇和李春波對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，為共同第一作者。

·論著·