老年性耳聾發(fā)病機(jī)制及基因修復(fù)治療進(jìn)展

黃海林　劉俊*

老年性耳聾發(fā)病機(jī)制及基因修復(fù)治療進(jìn)展

黃海林劉俊*

老年性耳聾又稱為年齡相關(guān)性耳聾［1］，是一個(gè)復(fù)雜的退行性疾病，是哺乳動(dòng)物衰老后在聽(tīng)覺(jué)器官表現(xiàn)的一種普遍現(xiàn)象。主要特點(diǎn)表現(xiàn)為隨著年齡增長(zhǎng)逐漸發(fā)生的雙側(cè)緩慢進(jìn)行性耳聾，其聽(tīng)力下降主要為高頻聽(tīng)力下降為主的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，同時(shí)伴有言語(yǔ)識(shí)別力差，尤其在噪聲環(huán)境中，中樞對(duì)聲音信息的加工過(guò)程緩慢，對(duì)聲音的定位能力下降等。在老年性耳聾的發(fā)展過(guò)程中，伴隨發(fā)生多種分子理化功能改變，導(dǎo)致DNA損傷的增加和線粒體功能下降。本文著重介紹老年性耳聾與線粒體DNA突變、線粒體氧化損傷的關(guān)系及其相關(guān)基因的修復(fù)作用并做一簡(jiǎn)要綜述。

1　老年性耳聾

老年性耳聾發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)增長(zhǎng)。據(jù)美國(guó)公共衛(wèi)生署統(tǒng)計(jì)，＞75歲的老年人約40%～66%有聽(tīng)力損失，而＞80歲的老年人＞80%有聽(tīng)力損失［2］。在我國(guó)，老年性耳聾已成為聽(tīng)力殘疾的首要因素，根據(jù)最近2006全國(guó)第二次殘疾人口普查，全國(guó)＞60歲老人中殘疾人有4420萬(wàn)，其中聽(tīng)力殘疾老年人占34.59%，占聽(tīng)力殘疾總?cè)丝?6.87%。由于耳聾，老年人不愿意與人交流溝通，使得性格逐漸變得急躁、孤僻，身心健康受到嚴(yán)重影響，嚴(yán)重時(shí)可能誘發(fā)老年性抑郁甚至引起癡呆癥。老年性耳聾不僅會(huì)嚴(yán)重影響老年人群的生活質(zhì)量，還會(huì)影響周?chē)】等巳旱纳?，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。但到目前為止，老年性耳聾的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明，目前尚缺乏切實(shí)、有效的防止手段。因此大多數(shù)學(xué)者致力于闡明老年性耳聾發(fā)病的分子機(jī)制，并且在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基因水平的防治研究。

2　老年性耳聾的病理改變及臨床分類

老年性耳聾的發(fā)生發(fā)展與眾多分子、生化和生理變化有關(guān)，包括線粒體DNA損傷增加和線粒體功能下降。老年性耳聾的病理變化主要涉及血管紋、耳蝸毛細(xì)胞、傳入神經(jīng)通路、聽(tīng)覺(jué)傳出神經(jīng)通路、耳蝸螺旋神經(jīng)元以及聽(tīng)覺(jué)中樞皮層的退變。但是，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，內(nèi)耳耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)的退變是老年性耳聾的關(guān)鍵。其具體病理變化主要包括4個(gè)方面［3］：（1）耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞萎縮變性，同時(shí)伴隨支持細(xì)胞的減少。（2）耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)纖維退變及變性。（3）血管紋基底膜增厚、鈣化、變性導(dǎo)致彈性減退引起能量傳導(dǎo)減少且ATP產(chǎn)生不足。（4）聽(tīng)覺(jué)中樞相對(duì)應(yīng)核團(tuán)細(xì)胞萎縮、減少及神經(jīng)纖維變性。根據(jù)老年性耳聾患者耳蝸的生理、病理學(xué)改變，情況將其分為四類型［4］：（1）感音性老年性耳聾：病理改變主要以毛細(xì)胞損傷為主，聽(tīng)力表現(xiàn)以高頻聽(tīng)力下降為主。（2）神經(jīng)性老年性耳聾：病理表現(xiàn)以螺旋神經(jīng)節(jié)和聽(tīng)神經(jīng)纖維萎縮減少和退行性變?yōu)樘卣?，?tīng)力表現(xiàn)為言語(yǔ)識(shí)別及鑒別能力降低。（3）血管紋性老年性耳聾：主要表現(xiàn)為血管紋萎縮，聽(tīng)力曲線為平坦型，但言語(yǔ)識(shí)別率尚正常。（4）傳導(dǎo)性老年性耳聾：其病變?yōu)閮?nèi)耳基底膜增厚和彈性減弱，聽(tīng)力曲線表現(xiàn)為高頻區(qū)下降明顯但言語(yǔ)辨別率相對(duì)較好。后來(lái)Katsarkas等［5］研究發(fā)現(xiàn)僅50%的老年性耳聾個(gè)體是符合單純Schuknecht分類，其他多屬于混合型老年性耳聾：其病理表現(xiàn)在光鏡下有多種病變，臨床上聽(tīng)力曲線為平坦型或陡峭型為主，此外后來(lái)學(xué)者又發(fā)現(xiàn)并新增了未定型老年性耳聾：其病理改變與聽(tīng)力曲線無(wú)相關(guān)性。

3　老年性耳聾與衰老氧化損傷的關(guān)系

老年性耳聾是由多種危險(xiǎn)因子的長(zhǎng)期累積共同作用的結(jié)果，其致病因素包括年齡、遺傳、環(huán)境以及自身健康（高血壓、糖尿病等），其中衰老是最重要的危險(xiǎn)因子。根據(jù)Harman提出衰老的自由基學(xué)說(shuō)，認(rèn)為衰老是由自由基引起的組織隨機(jī)毒害的結(jié)果，自由基損害作用的機(jī)制主要涉及DNA的損傷，尤其是線粒體DNA（mtDNA）的氧化損傷，其持續(xù)產(chǎn)生于線粒體電子傳遞鏈的活性氧簇（ROS）是衰老過(guò)程中線粒體DNA氧化損傷產(chǎn)生的主要原因［6］。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP給細(xì)胞供能，同時(shí)又產(chǎn)生具有毒性作用的副產(chǎn)物活性氧。正常情況下，機(jī)體為了應(yīng)對(duì)活性氧的氧化壓力，會(huì)調(diào)節(jié)自身體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)對(duì)抗氧化反應(yīng)，清除ROS。但隨著機(jī)體的衰老，不斷累積的ROS超過(guò)了細(xì)胞自身的抗氧化解毒作用，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，加上由于mtDNA暴露在高濃度的氧自由基環(huán)境下，缺乏組蛋白保護(hù)，因此mtDNA的突變率較核DNA高10～20倍［7］；另一方面，機(jī)體自身修復(fù)機(jī)制比較簡(jiǎn)單，DNA自我修復(fù)酶活性下降，導(dǎo)致其更易受到ROS的損傷，ATP產(chǎn)生不足，線粒體功能紊亂，最終導(dǎo)致不可逆聽(tīng)力損失［8］。正常生理情況下，體內(nèi)存在對(duì)ROS的防御機(jī)制如抗氧化酶、抗氧化劑、氧自由基清除劑如維生素C、維生素E、輔酶Q10和α-硫辛酸以及DNA修復(fù)系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗自由基氧化作用，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生ROS時(shí)，其可以及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。但機(jī)體處于衰老狀態(tài)時(shí)，因抗氧化物酶活性下降以及自身DNA堿基切除修復(fù)（BER）的衰退，導(dǎo)致大量ROS不能完全被清除而在機(jī)體中積累下來(lái)。不斷累積的ROS破壞生物膜產(chǎn)生丙二醛（MDA），同時(shí)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）活性隨著年齡增長(zhǎng)而降低，所以一般用MDA、SOD、GPX作為反映老化的指標(biāo)［9］，反映機(jī)體氧化損傷的程度。

4　線粒體DNA缺失與老年性耳聾的關(guān)系

老年性耳聾是常見(jiàn)的老年性疾病之一，但老年性耳聾的機(jī)制仍不清楚。一般認(rèn)為ROS通過(guò)損傷線粒體，使得核區(qū)和線粒體內(nèi)的DNA發(fā)生突變和缺失，這些缺失和突變?cè)诩?xì)胞、組織及機(jī)體的老化和退行性變中起主要作用，成為老年性耳聾重要的致病因素之一［10］。許多研究表明，線粒體DNA缺失突變和人類老年性耳聾關(guān)系密切。其中線粒體DNA 4977 bp是線粒體DNA中最常見(jiàn)的缺失片段（大鼠相應(yīng)為線粒體DNA4834bp），又被稱為線粒體DNA常見(jiàn)缺失（CD）［11］。此缺失突變不僅存在于衰老組織中，還可存在于線粒體腦肌病、進(jìn)行性眼外肌麻痹和Kearns-Sayre綜合征等疾病中，且隨著年齡增加在組織中逐漸積累［12］。

CD片段編碼包含泛醌氧化還原酶亞單位Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（ND3、ND4、ND5），細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ（COXⅢ），全部ATP合成酶亞單位Ⅵ（ATP6），部分ATP合成酶亞單位Ⅷ（ATP8）等，均是氧化磷酸化及電子傳遞過(guò)程的主要部位，造成一系列病理改變，導(dǎo)致老年性耳聾。有學(xué)者認(rèn)為線粒體DNA4977bp缺失突變發(fā)生后，可導(dǎo)致呼吸鏈酶蛋白合成障礙、線粒體氧化磷酸化功能降低、ATP生成減少，內(nèi)淋巴液離子失平衡，動(dòng)靜電位差平衡失調(diào)，最終內(nèi)環(huán)境紊亂，毛細(xì)胞發(fā)生非特異性損害，引起聽(tīng)力下降［13］。從最早Seidman發(fā)現(xiàn)老年性耳聾患者的顳骨標(biāo)本中存在mtDNA4977缺失，而在聽(tīng)力正常的老人顳骨標(biāo)本中，未發(fā)現(xiàn)類似缺失［14］，提示老年性耳聾與此突變有密切關(guān)系。近期，Markaryan等［15］應(yīng)用長(zhǎng)片段PCR的方法，在人類顳骨火棉膠切片中成功檢測(cè)出了線粒體DNA4977bp缺失突變和其他幾種線粒體DNA缺失突變的存在，并認(rèn)為缺失突變和聽(tīng)力下降有關(guān)，其發(fā)現(xiàn)老年性耳聾患者的顳骨標(biāo)本中普遍缺失的平均缺失突變率為32%，而相同年齡的正常人的缺失突變率為12%，表明線粒體突變只有累積到一定程度機(jī)體才會(huì)表現(xiàn)出老年性耳聾，驗(yàn)證了線粒體DNA的閾值效應(yīng)。同時(shí)劉紅［16］在檢測(cè)老年性耳聾患者毛干中MtDNA4977bp突變率時(shí)發(fā)現(xiàn)，重度耳聾患者線粒體DNA缺失量為（33.68±10.30）%，輕度耳聾患者線粒體DNA缺失量為（11.97±4.12）%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，劉俊等［17］觀察了老年大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)及耳蝸核MtDNA 的缺失，發(fā)現(xiàn)mtDNA4834 片段缺失率為66.7%和100%，在青年大鼠中并不出現(xiàn)mtDNA4834 的缺失，從而支持了 mtDNA 片段缺失與老年性耳聾發(fā)生有關(guān)的學(xué)說(shuō)。以上研究均表明mtDNA常見(jiàn)缺失突變與老年性耳聾密切相關(guān)，因此被研究者考慮作為衰老標(biāo)志物。但是并非所有老年性耳聾患者都有mtDNA4977，部分聽(tīng)力正常者甚至年輕人群也可檢測(cè)出mtDNA4977缺失突變。說(shuō)明線粒體普遍缺失突變?cè)诶夏晷远@中的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

5　線粒體DNA突變的修復(fù)及預(yù)防

根據(jù)衰老的自由基學(xué)說(shuō)，生物體衰老主要來(lái)源于機(jī)體代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的ROS，此過(guò)程是正常的衰老過(guò)程，是無(wú)法避免的。但可以通過(guò)減少和預(yù)防DNA突變的發(fā)生，來(lái)避免ROS堆積對(duì)細(xì)胞功能造成的危害。避免DNA突變積累的有效機(jī)制就是DNA修復(fù)。線粒體DNA修復(fù)機(jī)制包括：堿基切除修復(fù)（BER）、核酸切除修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)等，其中以BER最為重要。DNA聚合酶γ（DNA polγ）和8-氧鳥(niǎo)嘌呤糖苷酶（8-OGG1）是線粒體DNA堿基切除修復(fù)過(guò)程中兩個(gè)主要的修復(fù)酶。線粒體DNA聚合酶γ是動(dòng)物線粒體內(nèi)唯一的DNA聚合酶，不僅具有核苷酸聚合功能，還具有校正讀碼（但校正能力不足），及時(shí)糾正DNA在復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)堿基插入錯(cuò)誤的功能。人類8-羥基鳥(niǎo)嘌呤DNA 糖苷酶（8-hOGGl）蛋白是hOGGl基因的編碼產(chǎn)物，其主要功能是識(shí)別線粒體氧化損傷引起8-氧鳥(niǎo)嘌呤（8-oxoG）堿基修飾改變，并切除DNA雙鏈中的8-OHdG，對(duì)DNA進(jìn)行特異性的修復(fù)。Yuzefovych LV等［18］研究hOGGl基因表達(dá)水平不同的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)hOGGl基因表達(dá)的改變，可以影響DNA氧化損傷的修復(fù)，尤其是mtDNA的修復(fù)。Torres-Gonzalez M等［19］構(gòu)建OGGl腺病毒載體細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)Adv-OGGl過(guò)表達(dá)時(shí)能增強(qiáng)mtDNA修復(fù)能力，提高細(xì)胞活性，并認(rèn)為OGGl為mtDNA氧化損傷突變修復(fù)中的主要限速酶和調(diào)節(jié)酶類。因此，hOGG1有望成為未來(lái)干預(yù)老年性耳聾的重要因素之一，可以為以后基因治療老年性耳聾提供理論依據(jù)。此外，不少學(xué)者提出通過(guò)提高機(jī)體清除ROS能力，保護(hù)抗氧化酶系統(tǒng)，維持正常生理功能，來(lái)預(yù)防老年性耳聾的發(fā)生。Seidman等［20］發(fā)現(xiàn)通過(guò)應(yīng)用抗氧化劑，限制能量的攝入可以延緩年齡相關(guān)的聽(tīng)力損失進(jìn)展?？拙S佳等［21］學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明α-硫辛酸、維生素E、輔酶Q10對(duì)大鼠可以顯著降低大鼠線粒體DNA 4834 bp缺失突變的發(fā)生率，對(duì)線粒體DNA有明確的保護(hù)作用。

6　展望

本文總結(jié)了線粒體DNA缺失突變和ROS對(duì)線粒體功能氧化應(yīng)激損傷在老年性耳聾發(fā)展過(guò)程中的作用，認(rèn)為ROS對(duì)線粒體氧化損傷以及線粒體DNA常見(jiàn)缺失（CD）在老年性耳聾的發(fā)展進(jìn)程中扮演了重要角色。而且相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明DNA聚合酶γ（DNA polγ）以及8-OGG1可以識(shí)別線粒體DNA基因突變并進(jìn)行修復(fù)，為基因治療老年性耳聾提供了理論基礎(chǔ)。目前基因治療老年性耳聾還局限于理論及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚未成熟。常見(jiàn)的治療基因有Math1基因、Atoh1基因、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。其中Math1基因研究最多，有學(xué)者將Math1基因經(jīng)過(guò)腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至成年耳聾模型鼠，發(fā)現(xiàn)耳蝸Corti器有新生毛細(xì)胞再生，且呈現(xiàn)正常定位和形態(tài)，通過(guò)聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組聽(tīng)力較對(duì)照組大幅度提高［22］。另外Zhao Han等［23］研究發(fā)現(xiàn)將Atoh1基因傳染神經(jīng)干細(xì)胞后將其移植至豚鼠耳蝸，移植細(xì)胞在活體耳蝸內(nèi)存活，且可以正常分化為毛細(xì)胞并可使豚鼠恢復(fù)部分聽(tīng)力。由于老年性耳聾的基因致病機(jī)制復(fù)雜，而且面臨諸多技術(shù)、經(jīng)濟(jì)、倫理問(wèn)題，基因治療技術(shù)還有待研究。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，干細(xì)胞、基因治療必將取得突破，其它針對(duì)老年性耳聾的干預(yù)措施也會(huì)不斷進(jìn)步，可以有效防治老年性耳聾，老年性耳聾患者生活質(zhì)量將會(huì)明顯改善。

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310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（黃海林）310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（劉?。?/p>