樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗研究進(jìn)展

邵潔　鄒征云　杜娟　蘇舒　劉寶瑞*

樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗研究進(jìn)展

邵潔鄒征云杜娟蘇舒劉寶瑞*

樹突狀細(xì)胞（DC）是目前已知體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞（APC），廣泛分布于各種組織器官中，其抗原提呈能力為其他提呈細(xì)胞的數(shù)百倍，外源性抗原被DC攝取處理或內(nèi)源性抗原在胞內(nèi)被加工處理后成為抗原表位肽，并裝載至MHC-I或Ⅱ類分子，遞呈于DC表面，可激活幼稚CD4+T輔助細(xì)胞和未接觸過抗原的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞?；贒C的免疫治療，已經(jīng)被用于產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），其是對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的有效手段［1～4］。采用患者自身的抗免疫細(xì)胞，個(gè)體化過繼免疫殺傷腫瘤細(xì)胞有望成為有效治療腫瘤的一種方法［5］。

1　DC的分類及免疫學(xué)功能

1.1DC的分類 體內(nèi)的DC主要有兩種來源，即髓源性和血源性。髓源性DC是指由骨髓和臍血中CD34+ 造血祖細(xì)胞生成的 DC；而從外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的DC屬于血源性的。目前研究比較成熟且廣泛應(yīng)用的是髓源性DC，此類DC形態(tài)似單核細(xì)胞，以CD11C+為表型特征，約占外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.6%。髓源性DC在攝取和處理抗原以及控制免疫反應(yīng)的啟動(dòng)中起重要的作用。所有的DC都存在3種不同的分化狀態(tài)，即DC前體細(xì)胞、未成熟DC和成熟DC，關(guān)于不同分類和亞群的DC是否具有相同的DC前體細(xì)胞目前尚無統(tǒng)一定論。DC是在骨髓中由CD34+的造血前體細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下分化產(chǎn)生的，GM-CSF、IL-4、IL-3、干細(xì)胞因子、FLT3L均直接參與了DC的分化。DC離開骨髓后即成為未成熟DC，未成熟DC低量表達(dá)CD83、中等量表達(dá) B7- 1（CD80） 、CD40及ICAM-1（CD54）。而成熟DC表達(dá)豐富的MHC- I 類和 MHC-Ⅱ類分子，并高水平表達(dá)多種共刺激分子和表面分子如 CD80、CD83、B7- 2（CD86）、LFA-3（CD58）、CD54、ICAM-3（CD50）及CD40［6］。

1.2DC的免疫學(xué)功能 人血液和組織中分布的DC均為未成熟DC，未成熟DC捕獲抗原的能力強(qiáng)而刺激T淋巴細(xì)胞的能力弱。研究表明，DC有誘導(dǎo)和保護(hù)中樞性和周圍性免疫耐受的功能。在無適當(dāng)共刺激分子的情況下，未成熟DC遞呈組織抗原給T細(xì)胞，將導(dǎo)致T細(xì)胞無能或清除，未成熟DC的主要功能是捕獲抗原，誘導(dǎo)和保持免疫耐受。成熟DC的主要功能是遞呈抗原和激發(fā)免疫反應(yīng)，并且只有成熟DC才能刺激初始T淋巴細(xì)胞并激發(fā)免疫反應(yīng)的發(fā)生。DC成熟的重要特征包括MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)明顯增加并伴有共刺激分子的高表達(dá)，以及IL-12等細(xì)胞因子的分泌，以有利于刺激T細(xì)胞反應(yīng)。成熟的DC誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)主要以Th1型免疫反應(yīng)為主。對(duì)于腫瘤免疫治療，希望免疫反應(yīng)能夠向CD4+/CD8+介導(dǎo)的Th1/Tc1型免疫反應(yīng)方向發(fā)展。因此，如果將DC制備成疫苗希望其能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，那么，DC的成熟狀態(tài)就顯得尤為重要。如果使用的是未成熟的DC，結(jié)果可能是：不僅不能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，還可能誘導(dǎo)對(duì)腫瘤抗原的免疫耐受。因此，如何制備出成熟的DC是能否誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵問題。

2　腫瘤與DC缺陷

腫瘤與機(jī)體免疫之間的相互作用一直是研究和討論的熱點(diǎn)，關(guān)于免疫監(jiān)視為什么不能對(duì)腫瘤起作用是研究者普遍關(guān)注的問題。由于機(jī)體自身遭受免疫抑制、免疫耐受疾病或者自身免疫系統(tǒng)受到破壞導(dǎo)致功能缺陷，從而喪失或者減低其免疫監(jiān)控的能力，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)惡性病變細(xì)胞監(jiān)控失敗或者免疫忽略，引起APCs細(xì)胞功能低下［7，8］。有關(guān)人體腫瘤病灶中腫瘤浸潤(rùn)性樹突狀細(xì)胞（TIDCs）的研究充分證明如果荷瘤宿主體內(nèi)DC的功能缺陷，則其無法攝取吞噬并有效傳遞相關(guān)腫瘤抗原，并激發(fā)T淋巴細(xì)胞識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫功能。Chaux P等［9］認(rèn)為，腫瘤逃逸以及宿主免疫系統(tǒng)缺陷是由于CD80、CD86等共刺激分子表達(dá)缺陷所造成的。另有學(xué)者研究表明，TIDCs或荷瘤宿主的DC有與功能成熟的DC表面分子表達(dá)特征完全不同，如MHC類分子及相關(guān)共刺激因子低表達(dá)或不表達(dá)可能是荷瘤宿主體內(nèi)DC免疫功能缺陷，造成無法激活淋巴細(xì)胞的重要原因［10］。Vermi W等［11］研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤組織內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)數(shù)量微少且喪失免疫功能的DC，根本無法有效的激活T淋巴細(xì)胞，腫瘤逃逸免疫監(jiān)視的主要原因很可能與APCs的無能有關(guān)；Yanagimoto H等［12］發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者較正常機(jī)體循環(huán)血中DC的數(shù)量稀少并且難以發(fā)揮應(yīng)有的免疫活性。

最近的研究表明，DC的功能缺陷也是機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)重要的因素。DC雖然也常出現(xiàn)在腫瘤組織中或附近，但是常表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)的DC，這種DC不能遷移至淋巴結(jié)。腫瘤細(xì)胞釋放的因子，如前所述的VEGF、IL-10以及TGF-β等亦常下調(diào)DC激活T淋巴細(xì)胞的能力。有研究認(rèn)為，暴露在這些細(xì)胞因子中的DC，常引起不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，如Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，甚至誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的增加。因此，將DC分離脫離此種環(huán)境，在體外培養(yǎng)分化和誘導(dǎo)成熟是體外制備DC疫苗的一種優(yōu)勢(shì)。

3　DC疫苗的制備及促成熟因子

3.1DC的制備 由于DC僅占外周血中極少的一部分，因此要分離和培養(yǎng)DC以獲得治療量的DC一直是制約DC疫苗開展的重要技術(shù)關(guān)鍵。體外將單個(gè)核細(xì)胞在GM-CSF和IL-4的誘導(dǎo)下分化為DC的方法成功解決了這一技術(shù)難題，使DC能在體外大量培養(yǎng)并達(dá)到治療用的劑量。另一類制備DC的方法是由CD34+骨髓前體細(xì)胞在GM-CSF和TNF-a等多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下分化而來［13］。有研究報(bào)道此類DC與漿細(xì)胞DC類似能夠在病毒或者Toll樣受體7刺激物作用下分泌IFN-α。Mohty等［14］通過誘導(dǎo)自噬抑制溶酶體蛋白酶體活性，富集自噬小體，其中包含了各種類型的腫瘤細(xì)胞抗原，包括長(zhǎng)壽蛋白、短壽蛋白和錯(cuò)誤編碼、錯(cuò)誤翻譯等產(chǎn)生的廢蛋白DRiPs。其將這些富含自噬小體的囊泡稱作DRibbls。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)中隔離較多類型抗原，能在體內(nèi)外高效的交叉激活抗原特異性CD8+T細(xì)胞。

3.2促成熟和趨化因子的使用 DC的成熟狀態(tài)是決定能否激發(fā)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子可以促使DC成熟，在體外培養(yǎng)DC的過程中，TNF-a是促成熟常用的一個(gè)細(xì)胞因子，使用TNF-a制備的DC疫苗對(duì)抗腫瘤免疫治療能產(chǎn)生積極的作用。目前采取何種方法促成熟的方案還無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但是必須引起重視的是，不管如何制備DC疫苗和采取何種促成熟方案，促成熟步驟是必須的，因?yàn)橹挥谐墒斓腄C才能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。DC在成熟的過程中，在趨化因子的作用下向二級(jí)淋巴器官遷移，后與初始T淋巴細(xì)胞作用并啟動(dòng)免疫反應(yīng)。若給予PGE2，可增加成熟DC表達(dá)CCR7，有利于DC向淋巴結(jié)遷移。有研究發(fā)現(xiàn)，前2d加入IL-4、GM-CSF共同培養(yǎng)，48h后加入OK432、PGE2聯(lián)合INF-a促進(jìn)成熟，獲得的成熟DC具有更好的誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分化，可以分泌更多的IFN-γ；而且成熟的DC具有更好的遷移能力，誘導(dǎo)出更多的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮更強(qiáng)的殺瘤能力［15］。

4　不同抗原負(fù)載模式的DC腫瘤疫苗

4.1腫瘤抗原肽負(fù)載疫苗 腫瘤抗原肽（包括合成肽）或腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原與自身或同種異體的DC共育，DC與腫瘤表位肽結(jié)合后，可誘導(dǎo)CD8+CTL及CD4+T輔助細(xì)胞的應(yīng)答及Th1和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前已知的抗原肽來源于眾多腫瘤相關(guān)抗原（TAA），包括人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）、黑色素瘤抗原、癌胚抗原（CEA）、p53、Survivin、Her-2/Neu等［16］。用腫瘤抗原多肽致敏DC具有較好的靶向性，不易產(chǎn)生自身免疫性疾病。但僅能提供有限的腫瘤抗原表位，MHC限制性的存在，易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

4.2腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載疫苗 由于目前僅部分腫瘤的相關(guān)抗原或特異性抗原已知，大部分腫瘤仍未明確。而腫瘤全細(xì)胞抗原含有全部的腫瘤抗原，因而無需明確腫瘤特異性抗原，可提供大量的腫瘤抗原表位，無MHC限制性，因此出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞逃逸的可能性較小。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)安全有效，并可以在晚期轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者中達(dá)到31.7%（13/41）的臨床獲益［17］。此類抗原包括凋亡壞死腫瘤細(xì)胞裂解物或提取物、完整腫瘤細(xì)胞等。Palmer等［18］對(duì)35例晚期肝癌患者進(jìn)行Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，使用肝癌細(xì)胞系HepG2致敏肝癌患者DC，結(jié)果顯示疾病控制率（部分臨床反應(yīng)和病情穩(wěn)定3個(gè)月）為28%。腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載的 DC腫瘤疫苗的缺點(diǎn)為含非腫瘤相關(guān)抗原量大且種類多，易誘發(fā)自身免疫性疾病，所需腫瘤細(xì)胞數(shù)量多，最佳刺激量難以確定。

4.3腫瘤細(xì)胞來源的基因修飾的疫苗 腫瘤抗原編碼基因、細(xì)胞因子基因或趨化因子基因?qū)隓C增強(qiáng)了免疫原性，并可在其內(nèi)持續(xù)表達(dá)腫瘤抗原，增強(qiáng)了MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ分子遞呈抗原的能力［19］。轉(zhuǎn)染RNA也可以高效的誘導(dǎo)特異性CTL 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，體外研究已在多種腫瘤上證明其有效性［20］。但亦存在運(yùn)送效率不穩(wěn)定、技術(shù)要求高、蛋白表達(dá)不穩(wěn)定的問題。同時(shí)由于正常體細(xì)胞抗原表位的存在，致敏DC后能表達(dá)MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子及其刺激分子，會(huì)使疫苗的抗瘤作用明顯提高。

5　DC腫瘤疫苗聯(lián)合應(yīng)用模式

5.1聯(lián)合化療 化療殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，本身刺激了腫瘤抗原的廣泛釋放，刺激了免疫細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的抗原提呈作用。而小劑量持續(xù)化療較之于傳統(tǒng)化療，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，還能影響癌周微環(huán)境，抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)［21］。在小鼠大腸癌模型中，DC疫苗加入FOLFRI方案能夠抑制化療后髓源性免疫抑制細(xì)胞（MDSC） 和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的反彈，增加CEA特異性Th1和CTL反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤作用。近年的一些臨床前研究發(fā)現(xiàn)化療藥，尤其是環(huán)磷酰胺，在一定條件下可增強(qiáng)疫苗的免疫反應(yīng)，目前這一概念已經(jīng)被引入一些臨床試驗(yàn)［22］。

5.2聯(lián)合放療 由于放療可以引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞表型改變，因此也有誘發(fā)DC介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的潛能。DC行使腫瘤免疫的關(guān)鍵在于遞呈腫瘤抗原，放療可引起免疫原性腫瘤細(xì)胞死亡，腫瘤抗原釋放增加，無疑增加了DC吞噬并遞呈腫瘤抗原的機(jī)會(huì)。此外放療也改變了腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，產(chǎn)生活性氧（ROS），引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）壓力，釋放免疫活化細(xì)胞因子及趨化因子，釋放損傷相關(guān)分子（DAMPs），增強(qiáng)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞引起的對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解作用。放療本身可以誘發(fā)抗腫瘤免疫，這也可以解釋放療以外的腫瘤消退放療旁觀者效應(yīng)。因此近年來人們的思維模式已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)變，傾向于在對(duì)局部腫瘤實(shí)施放療控制負(fù)荷以后，加以額外的免疫治療強(qiáng)化、保障放療之后的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

5.3聯(lián)合其他免疫治療 目前已知，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）通過抑制腫瘤抗原呈遞封鎖髓系DC分化和成熟，導(dǎo)致腫瘤的免疫耐受，而抗VEGF治療則可以減少CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)，增加CTL生成，增強(qiáng)疫苗作用。一項(xiàng)針對(duì)血清學(xué)復(fù)發(fā)的前列腺癌患者的研究已經(jīng)證實(shí)疫苗和貝伐單抗聯(lián)合應(yīng)用可以誘導(dǎo)高免疫反應(yīng)［23］。貝伐單抗還可能通過促進(jìn)T細(xì)胞向腫瘤歸巢改善疫苗功能，已經(jīng)有將DC疫苗聯(lián)合貝伐單抗合應(yīng)用于臨床的Ⅰ期研究。CTLA-4與B7分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)。在結(jié)腸癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合CTLA-4封鎖和耗竭CD25+Treg，可增強(qiáng)DC疫苗的腫瘤免疫。

6　展望

近年來，應(yīng)用DC腫瘤疫苗治療腫瘤，被廣泛研究并部分應(yīng)用于臨床治療，取得了一定的成績(jī)。當(dāng)然，要使DC腫瘤疫苗真正成為臨床上能廣泛應(yīng)用的腫瘤疫苗還面臨著各種桃戰(zhàn)，未來還需要針對(duì)腫瘤特殊的免疫抑制環(huán)境，整合DC疫苗以及其他的免疫治療模式，形成更強(qiáng)大的腫瘤免疫治療組合。

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