超高效合相色譜—質(zhì)譜法快速檢測工業(yè)油酸中5種常見的脂肪酸

林春花+范乃立+芮培欣+夏劍輝+廖維林+楊紹明

摘 要 采用超高效合相色譜-質(zhì)譜（UPC2-MS）技術(shù)，建立了工業(yè)油酸中5種常見的脂肪酸（軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸）的快速檢測方法。樣品用正己烷溶解，采用超臨界CO2-甲醇/乙腈（1∶1， V/V）梯度洗脫，經(jīng)Acquity UPC2BEH 2-EP色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）分離，通過質(zhì)譜檢測器在負離子電噴霧模式下對目標化合物進行分析，外標法定量。通過對UPC2-MS條件的優(yōu)化，5種脂肪酸在3 min內(nèi)實現(xiàn)有效分離，目標物在0.5～100 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性（相關(guān)系數(shù)大于0.9985）; ?在3個添加水平下，5種脂肪酸的回收率在89.3%～106.7%之間，相對標準偏差為0.8%～3.0%; 方法檢出限（S/N≥3）為0.07～0.26 mg/L。實際樣品分析結(jié)果表明，本方法不但簡單快速，分離效果好，而且無需對脂肪酸樣品進行衍生化，同時為UPC2在油脂類相關(guān)領(lǐng)域的研究與開發(fā)提供一種快速有效的檢測方法。

關(guān)鍵詞 超高效合相色譜-質(zhì)譜法; 工業(yè)油酸; 未衍生化; 脂肪酸

1 引 言

工業(yè)油酸是一種重要的化工中間體，可用于生產(chǎn)脂肪酸甲酯、生物柴油等，市場需求較大^[1]。它是以植物油脂、皂腳為原料，通過水解、精餾而得到的一種混合脂肪酸，主要含有5種脂肪酸，其中以油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）為主，還含有少量的軟脂酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）和亞麻酸（C18∶3）等^[2]。原料和生產(chǎn)方法的差異會造成工業(yè)油酸中5種脂肪酸含量的不同^[2]，而脂肪酸的不同比例將造成工業(yè)油酸的品類不同，因此建立快速、準確地檢測這5種脂肪酸含量的方法是區(qū)分工業(yè)油酸品類的必然選擇。

目前，對于脂肪酸的檢測方法主要是氣相色譜法[3～9]和液相色譜法^[10，11]等，這些方法一般都要對樣品進行脂肪酸衍生化的前處理^[12]。近年來，也出現(xiàn)了采用超臨界流體色譜法^[13，14]、超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法^[15]和快速氣相色譜法^{[16，17]}直接分析未衍生化脂肪酸的文獻報道。但是，這些方法都有各自的不足之處。如衍生化不僅操作繁瑣耗時，而且衍生化反應(yīng)是否完全等因素直接影響產(chǎn)物的準確測定; 蒸發(fā)光散射檢測器會降低分析的靈敏度，低濃度樣品的分析受到一定的限制^[7]; 氣相色譜直接分析脂肪酸樣品時，多次進樣后高沸點物質(zhì)的殘留會大大降低色譜柱的使用壽命等; 超臨界流體色譜法分析油脂類樣品雖能得到更好的分離結(jié)果^[18]，但由于其對儀器的硬件要求非常高，使得該技術(shù)在很長的時間內(nèi)沒有得到長足的發(fā)展。

超高效合相色譜（Ultra-performance convergence chromatography， UPC2）技術(shù)是Waters公司于2012年8月新推出的一種分離技術(shù)^[19，20]。該技術(shù)基于超臨界流體色譜技術(shù)原理，其流動相以超臨界CO2為主要組成，輔助少量的有機溶劑，具有粘度低、分子擴散快、分離效率高、綠色環(huán)保的優(yōu)勢。本研究利用超高效合相色譜-質(zhì)譜技術(shù)建立了上述5種結(jié)構(gòu)類似的脂肪酸的簡便、快速檢測方法，為工業(yè)油酸中5種重要的脂肪酸的快速分析以及UPC2技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Acquity UPC2系統(tǒng)（美國Waters 公司）， 配Waters SQD 2 質(zhì)譜檢測器。Acquity UPC2BEH 2-EP 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）、Acquity UPC2BEH 色譜柱（100 mm ×3 mm， 1.7 μm）、Acquity UPC2HSS C18 SB 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm）和Acquity UPC2CSHTM Fluoro-Phenyl Column 色譜柱（100 mm × 3 mm， 1.7 μm， 美國Waters公司）。TOLEDO AL204型電子天平（瑞士METTLER 公司）。PURELAB Ultra MK 2型超純水儀（英國ELGA 公司）?？烧{(diào)式移液器（上海大龍公司）。

5種脂肪酸標準品：軟脂酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）和亞麻酸（C18∶3）均購自Sigma Aldrich公司（純度大于99%）; 正己烷、甲醇和乙腈（色譜純，德國Merck公司）; 甲酸銨和醋酸銨（色譜純，美國Agilent公司）。實驗用水為超純水。工業(yè)油酸（棉籽油酸、大豆油酸和菜籽油酸）均來源于湖北天門市誠鑫化工有限公司。

2.2 實驗條件

2.2.1 色譜條件 ?采用 Acquity UPC2BEH 2-EP色譜柱; 系統(tǒng)背壓為13.78 MPa; 色譜柱溫度為

2.3 混合標準溶液的配制

分別準確稱取0.05 g（精確至0.001 g）各種脂肪酸標樣，用正己烷溶解并分別定容至50 mL，制備成1 g/L的單一標準品儲備液; 再用正己烷制備成濃度為100 mg/L混合標準溶液，并稀釋成系列標準工作溶液。

2.4 樣品制備

準確稱取0.01 g（精確至0.0001 g）工業(yè)油酸樣品，用正己烷溶解并定容至10 mL，再稀釋至100 mg/L，經(jīng)有機膜過濾后直接進行UPC2系統(tǒng)分析。endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

本實驗測定的5種脂肪酸，具有結(jié)構(gòu)類似、難于分離的特點; 另外，UPC2系統(tǒng)所使用的亞2 μm色譜柱涵蓋了正相和反相色譜柱類別。本實驗考察了4種固定相差異明顯的色譜柱，分別為Acquity UPC2BEH，BEH 2-EP， HSS C18 SB以及CSHTM Fluoro-Phenyl。從實驗結(jié)果（圖2）可見，本實驗條件下Acquity UPC2BEH 2-EP色譜柱能夠更好地實現(xiàn)5種脂肪酸的有效分離。

3.2 流動相中助溶劑的選擇

UPC2系統(tǒng)所使用的流動相主要是CO2，并以少量有機溶劑作為助溶劑進行分離; 不同類別的有機溶劑對目標物的分離也會產(chǎn)生一定影響。因本研究是UPC2系統(tǒng)接入MS檢測器，因此助溶劑以甲醇和乙腈為主要研究對象。實驗考察了3種有機溶劑（甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1， ?V/V））對5種脂肪酸的分離影響。從圖3可見，3種溶劑在本方法中對脂肪酸的洗脫能力為：甲醇﹥甲醇-乙腈（1∶1， V/V）﹥乙腈; 3種溶劑的選擇性存在差異，其中甲醇-乙腈（1∶1， V/V）和乙腈分離效果相當(dāng)，但乙腈保留時間相對較長。綜合考慮洗脫能力和分離效果，本實驗最終采用甲醇-乙腈（1∶1， V/V）為有機溶劑輔助流動相。

3.3 色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓的選擇

在UPC2方法開發(fā)中，色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓可以作為兩個重要的參數(shù)進行分離條件的優(yōu)化。改變色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓，就會顯著改變以壓縮的CO2為主的流動相的密度和性能，從而改變其洗脫能力和選擇性。本實驗考察了柱溫（40，50和60 ℃）和系統(tǒng)背壓（12.41，13.78和14.83 MPa）對分離的影響，從圖4可見，隨著柱溫升高和背壓降低，脂肪酸的保留值增加。當(dāng)柱溫為60 ℃時，C16∶0和C18∶3的峰形拖尾，展寬明顯，而過高的背壓易使UPC2系統(tǒng)壓力過大。綜合考慮分離效果與分析效率，最終確定柱溫為50 ℃，系統(tǒng)背壓為13.78 MPa。

3.4 MS中補償溶劑的選擇

在MS方法開發(fā)中，不同的補償溶劑對目標物的離子化效率也會產(chǎn)生一定的影響。實驗考察了3組不同的補償溶劑甲醇（含1%水）、甲醇（含0.1%甲酸銨）、甲醇（含0.1%醋酸銨）和不同的流速（0.1， 0.2和0.3 mL/min）對5種脂肪酸分離的影響。在相同的梯度洗脫條件下，甲醇-1%水作為補償溶劑，且流速為0.2 mL/min時，目標物離子化效果最好，色譜峰尖銳、對稱響應(yīng)靈敏度高，5種脂肪酸分離效果最好。

3.5 方法評價

配制0.5， 5， 25， 50和100 mg/L的混合標準溶液，在優(yōu)化的色譜條件下進行檢測，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（x， mg/L）進行線性回歸，得線性回歸方程。向已知含量的工業(yè)油酸樣品中分別添加5種成分的脂肪酸標準品，設(shè)置3個添加水平，每個水平重復(fù)測定5次，并計算加標回收率和精密度。按信噪比S/N≥3計算得到分析方法的檢出限（LOD）。結(jié)果（表2）表明，5種脂肪酸在0.5～100 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.9985），3個加標水平的回收率為89.3%～106.7%，RSD為0.8%～3.0%，LOD為0.07～0.26 mg/L，可滿足實際樣品測定的需要。

3.6 實際樣品分析

采用本方法對棉籽油酸、大豆油酸和菜籽油酸3種植物油樣品進行檢測，檢測結(jié)果（表3）表明，3種工業(yè)油酸中5種脂肪酸的含量和比例不同。其中，棉籽油酸和大豆油酸以亞油酸為主，而菜籽油酸則是以油酸為主。但總體而言，以這3種植物油為原料所生產(chǎn)的工業(yè)油酸都是以油酸、亞油酸為主，且這兩種脂肪酸總含量均大于80%。典型的樣品色譜圖如圖5所示。

通過對色譜柱、色譜柱溫度、系統(tǒng)背壓和質(zhì)譜等條件的優(yōu)化和考察，建立了超高效合相色譜-質(zhì)譜快速檢測工業(yè)油酸中5種脂肪酸的分析方法。本方法能在3 min內(nèi)實現(xiàn)5種脂肪酸的有效分離，采用CO2作主要流動相，實現(xiàn)了高分離度、高靈敏度、高分析速度、低成本的目標。

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Rapid Detection of Five Common Fatty Acids ?in Industrial Oleic

Acid Based on Ultra Performance Convergence

Chromatography-Mass Spectrometry

LIN Chun-Hua1， FAN Nai-Li1， RUI Pei-Xin1， XIA Jian-Hui*1， LIAO Wei-Lin1， YANG Shao-Ming2

1（National Monosaccharide Chemical Synthesis Engineering Research Center， Nanchang 330027， China）endprint

2（Department of Chemistry and Chemical Engineering， School of Basic Sciences，

East China Jiaotong University， Nanchang 330013， China）

Abstract A rapid method was developed for the determination of 5 common fatty acids， palmitic acid， stearic acid， oleic acid， linoleic acid and linolenic acid in industrial oleic acid based on ultra-performance convergence chromatography-mass spectrometry （UPC-MS）. The sample was dissolved by n-hexane， followed by clean-up of extract using 0.22 μm organic phase filter. The fatty acids were separated in 3 min on the column of Acquity UPC2 BEH 2-EP by gradient elution with carbon dioxide and methanol/acetonitrile （1∶1， V/V） system， and finally detected by MS detector in ESI- ?mode. Through the optimization of UPC2-MS condition， the reasonable linearity was achieved for all the analytes over the range of 0.5-100 mg/L with the correlation coefficients （R2） greater than 0.9985. The recoveries for five fatty acids at three spiked levels were in the range from 89.3% to 106.67% with relative standard deviations of 0.8%-3.0%. The limits of detection for target compounds in the method ranged from 0.07 mg/L to 0.26 mg/L. The real sample analysis showed that this method was simple，fast and had a good separation effect. There was no need of derivatization for fatty acid samples. This work would provide a fast and effective detection method for UPC2 technology in oil related research field.

Keywords Ultra performance convergence chromatography-mass spectrometry; Industrial oleic acid; ?Underivatization; fatty acids

（Received 20 August 2014; accepted 15 October 2014）

This article is funded by the National Science and Technology Support Project（NO.2012BAE07B00）endprint