全血改進(jìn)線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)基因多態(tài)性

項(xiàng)錚+劉云龍+邢曉清+初亞男+宋沁馨+周國(guó)華

摘 要 焦磷酸測(cè)序是目前基因多態(tài)性檢測(cè)的主要方法之一，但是其前期的樣本制備工作較為繁瑣，限制了其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。為了簡(jiǎn)化焦磷酸測(cè)序的流程，本研究根據(jù)不對(duì)稱PCR原理，改進(jìn)了線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LATE-PCR）的引物設(shè)計(jì)方法，增加過量引物的長(zhǎng)度和濃度，并結(jié)合全血直接擴(kuò)增技術(shù)，建立了基于普通rTaq聚合酶和高pH 緩沖液（HpH Buffer）的全血改進(jìn)LATE-PCR（Improved LATE-PCR， imLATE-PCR）方法?？疾炝朔椒ǖ淖顑?yōu)擴(kuò)增體系、血液抗凝劑對(duì)其影響以及全血模板量。采用單管、一步法直接擴(kuò)增出單鏈測(cè)序模板，成功地對(duì)24例臨床血樣的乙醇脫氫酶基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可用于指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥。24例樣本的基因型分別為ADH1B位點(diǎn)AA純合6例、AG雜合14例、GG純合4例; ADH1C位點(diǎn)GG純合20例、AG雜合4例、AA純合0例。

關(guān)鍵詞 全血直接擴(kuò)增; ?線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng); ?焦磷酸測(cè)序; ?基因多態(tài)性; ?酒精代謝

1 引 言

隨著基因組學(xué)及后基因組學(xué)的發(fā)展，人們意識(shí)到基因多態(tài)性在闡明疾病的發(fā)生和發(fā)展、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現(xiàn)的多樣性以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)上都起著重要作用，而單核苷酸多態(tài)性是目前最受關(guān)注的一類多態(tài)性。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是通過核苷酸和單鏈模板結(jié)合后釋放焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)的一種核酸測(cè)序技術(shù)[1～3]，用于基因多態(tài)性檢測(cè)^[4]、微生物分型^[5]、基因甲基化檢測(cè)^[6]等領(lǐng)域，尤其是在大規(guī)模DNA測(cè)序中^[7]的應(yīng)用，使測(cè)序技術(shù)發(fā)生了革命性變化。但是目前焦測(cè)序的單鏈模板制備主要采用固相微球法^[8]，該方法操作步驟繁瑣且效率較低; 使用生物素標(biāo)記引物、鏈親和素包被微球增加了檢測(cè)的成本; 同時(shí)，單鏈制備過程中容易引起樣品的交叉污染，以上不足極大地妨礙了焦測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用^[9]。

為了解決單鏈模板制備問題，可以采取不對(duì)稱PCR直接產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物^[10]，但常規(guī)不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增單鏈的效率低，無法得到廣泛使用。線性指數(shù)PCR（Linear-after-the exponential-polymerase chain Rreaction， LATE-PCR）^[11]在不對(duì)稱PCR的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化引物濃度和Tm值，可獲得接近對(duì)稱PCR的擴(kuò)增效率，產(chǎn)生大量單鏈DNA產(chǎn)物，能夠滿足基于單鏈核酸序列的雜交、實(shí)時(shí)熒光PCR等反應(yīng)的需要^[12]。但是LATE-PCR引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格，且隨著PCR的進(jìn)行，非限制性引物與擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，若擴(kuò)增片段較長(zhǎng)則得到的單鏈DNA產(chǎn)率會(huì)降低。改進(jìn)的LATE-PCR方法（Improved LATE-PCR， imLATE-PCR）^[13]彌補(bǔ)了LATE-PCR的不足，增加非限制性引物長(zhǎng)度，減少限制性引物長(zhǎng)度，使兩者的Tm差值更大，引物的設(shè)計(jì)相較于LATE-PCR更為寬泛，產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度也更長(zhǎng)，擴(kuò)大了不對(duì)稱PCR的實(shí)際使用范圍。

為了提高基因檢測(cè)速度，降低樣本污染的可能性，本研究將全血直接擴(kuò)增和imLATE-PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了基于普通rTaq聚合酶和“高pH緩沖液（HpH Buffer）”的全血imLATE-PCR擴(kuò)增方法。本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)便。采用全血直接作為擴(kuò)增單鏈DNA測(cè)序的模板，省去了DNA提取和單鏈模板制備兩個(gè)繁瑣的步驟，極大提高了檢測(cè)速度，簡(jiǎn)化了操作過程，縮短了檢測(cè)時(shí)間; （2）成本低，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。無需制備DNA單鏈可以避免使用生物素修飾引物和磁性微球，無需DNA提取可以省去大量有機(jī)試劑和實(shí)驗(yàn)耗材，降低了成本; （3）污染少。避免了DNA提取和模板制備過程中反復(fù)打開管蓋進(jìn)行加液、移液等操作，減少了平行測(cè)多份樣品時(shí)交叉污染的可能性; （4）靈敏度高。實(shí)驗(yàn)表明， 0.1 μL全血即采用指尖取血即可得到較好的測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用于臨床檢測(cè)方便、快速^[14]。采用本方法對(duì)酒精代謝相關(guān)基因ADH1B、ADH1C進(jìn)行了基因多態(tài)性焦測(cè)序檢測(cè)，用于臨床快速評(píng)估人體酒精代謝能力，對(duì)于預(yù)防與飲酒行為相關(guān)的多種疾病，以及常規(guī)體檢監(jiān)測(cè)有重要意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EDC-10基因擴(kuò)增儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）; 小型焦測(cè)序儀（日本Hitachi公司）。

三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP-sulfurylase）和Klenow聚合酶為實(shí)驗(yàn)室自表達(dá); rTaq DNA聚合酶、500 bp DNA Ladder marker（日本Takara公司）; 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、QuantiLum重組熒光素酶（美國(guó)Promega公司）; 腺苷三磷酸雙磷酶-Ⅶ（Apyrase-Ⅶ）、腺苷-5′-磷酸硫酸（Adenosine 5′-phosphosulfate， APS）、牛血清蛋白（Bovine serum albumin， BSA）（美國(guó)Sigma公司）; Sepharose Beads（美國(guó)GE Healthcare公司）; α-硫化三磷酸腺苷 （dATPαS）、三磷酸脫氧胞苷酸（dCTP）、三磷酸脫氧鳥苷酸（dGTP）、三磷酸脫氧胸腺苷酸（dTTP）（美國(guó)Amersham Pharmacia公司）; 其它試劑均為分析純; 實(shí)驗(yàn)用水均為滅菌二次蒸餾水。endprint

所有引物由上海Invitrogen公司合成，具體引物名稱及序列見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 imLATE-PCR引物設(shè)計(jì) 本研究選取與酒精代謝相關(guān)的乙醇脫氫酶（ADH）基因中中國(guó)人較常見位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物使用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)原則：TmE-TmL≥5 ℃; TmA-TmE≤13 ℃^[13]（TmE為過量引物Tm值，TmL為限制性引物Tm值，TmA為擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值）。Tm值計(jì)算采用OligoAnalyzer 3.1軟件（地址：http：//www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/）。本實(shí)驗(yàn)中所用到的PCR擴(kuò)增引物見表1。

2.2.2 全血imLATE-PCR擴(kuò)增 取抗凝外周全血樣本1μL（本研究中血樣均來源于南京軍區(qū)總院受試者，受試者已簽署知情同意書并獲得倫理委員會(huì)同意。除特別說明，抗凝血所用抗凝劑均為EDTA二鉀。）直接用于ADH1B、ADH1C位點(diǎn)的目的片段擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系包括用于全血PCR 反應(yīng)的HpH Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，pH 9.3～9.5）5.35 μL，2 mmol/L Mg2+，dNTPs 100 μmol/L，過量引物（PE）1 μmol/L，限制性引物（PL）0.1 μmol/L，Taq 酶2.5 U，適當(dāng)PCR添加劑（10% BSA和5% 吐溫20），全血模板1 μL，加水補(bǔ)充至50 μL。ADH1B位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件：3個(gè)循環(huán)（94 ℃， 3 min; 55 ℃， 3 min）; ? 65個(gè)循環(huán)（90 ?℃， 10 s; 53 ?℃， 20 s; 72 ?℃， 20 s）。ADH1C位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件： 94 ?℃預(yù)變性3 min; ?65個(gè)循環(huán)（90 ?℃，10 s; 55 ?℃， 20 s; 72 ℃， 20 s）。

2.2.3 單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物處理以及焦磷酸測(cè)序 imLATE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物除了大量單鏈DNA可用做測(cè)序模板，還含有過量的dNTPs、延伸產(chǎn)生的PPi、部分未完全延伸的產(chǎn)物等，這些成分都會(huì)對(duì)后續(xù)的焦測(cè)序反應(yīng)造成影響。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)過處理后方可進(jìn)行焦測(cè)序反應(yīng)。本研究使用自制的焦測(cè)序反應(yīng)液^[15]對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行處理，主要成分為0.1 mol/L Tris-HAc（pH 7.7），2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg（Ac）2， 0.1% BSA，1 mmol/L DTT，80 μmol/L APS，0.4 mmol/L D-蟲螢光素，60 U/mL ATP-sulfurylase，1.6 U/mL Apyrase-Ⅶ，18 U/mL Klenow聚合酶，適量熒光素酶。反應(yīng)液中的APS可以和延伸產(chǎn)生的PPi作用生成ATP，過量的dNTPs和少量的ATP可以在Aprase-Ⅶ作用下發(fā)生降解，從而減少對(duì)焦測(cè)序反應(yīng)的影響^[10]。具體步驟為：取3 μL imLATE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入自制焦測(cè)序反應(yīng)液，置于小型焦磷酸測(cè)序儀中，室溫反應(yīng)5 min; 加入10 pmol測(cè)序引物，常溫下退火5 min，再循環(huán)加入dATPαS， dCTP， dTTP 和dGTP 進(jìn)行焦測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序引物如下： ADH1B： 5′-ATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC-3′， ADH1C： 5′-TTTCGTTTGAAGTCATCGGTC-3′。

3 結(jié)果與討論

3.1 PCR擴(kuò)增體系對(duì)全血imLATE-PCR的影響

以全血代替DNA作為模板，其中的免疫球蛋白G、血紅蛋白和乳鐵蛋白等成分會(huì)抑制PCR反應(yīng)，且常用血液抗凝劑EDTA或肝素也會(huì)抑制PCR反應(yīng)。所以，采用全血代替DNA作為PCR反應(yīng)模板時(shí)，需要調(diào)整PCR反應(yīng)體系。本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的“HpH Buffer”體系可以很大程度上減少全血成分對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，主要由于高pH值的緩沖體系可以使蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電，抑制其與帶負(fù)電的基因組DNA相互作用，從而降低對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用^[16]。

3.2 全血imLATE-PCR擴(kuò)增血液模板量考察

考察了上述方法在進(jìn)行全血imLATE-PCR擴(kuò)增時(shí)，0.05， 0.10， 0.50， 1.00和2.00 μL 5個(gè)模板加入量對(duì)擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果的影響。結(jié)果表明，50 μL擴(kuò)增體系中加入0.10～2.00 μL的EDTA抗凝全血作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)處理后進(jìn)行焦測(cè)序，均可得到良好的焦測(cè)序結(jié)果（圖2），擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)平均單堿基信號(hào)值分別為0.629、0.794、0.879、0.883，均可進(jìn)行準(zhǔn)確的SNP分型。由此證明，本方法僅需0.10 μL全血樣本就可對(duì)乙醇脫氫酶的兩個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行焦測(cè)序檢測(cè)并分型，大大減少了對(duì)病人的創(chuàng)傷。

3.3 乙醇脫氫酶ADH1B、ADH1C基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)

對(duì)收集到的24例臨床血樣的乙醇脫氫酶基因ADH1B、ADH1C的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，本方法測(cè)序結(jié)果較好，測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度高，可以進(jìn)行準(zhǔn)確的SNP分型。24例樣本的基因型測(cè)序結(jié)果如表2所示，其中ADH1C位點(diǎn)AA純合型本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到，而NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)也顯示了亞洲人群中AA型基因頻率接近于0。為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從24例樣本中抽取10例進(jìn)行Sanger測(cè)序（圖4），結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果完全一致，證明了本方法的準(zhǔn)確性。ADH1B位點(diǎn)的AA型和ADH1C位點(diǎn)的GG型的患者酒精代謝能力較強(qiáng)，可加快乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化的速度，易產(chǎn)生面紅、惡心等反應(yīng)，使飲酒者對(duì)乙醇耐受性降低，一定程度上可以避免產(chǎn)生酗酒或酒精依賴^[17]; ADH1B位點(diǎn)的GG純合型和ADH1C位點(diǎn)的endprint

AA型患者的乙醇代謝能力較弱，易產(chǎn)生酒精依賴和酒精濫用，臨床應(yīng)建議減少酒精的攝入^[18]。

考察了臨床上常用的3種血液抗凝劑EDTA二鉀、檸檬酸鈉和肝素鈉對(duì)全血imLATE-PCR擴(kuò)增的影響。結(jié)果表明，3種抗凝劑對(duì)擴(kuò)增無明顯影響，均能夠得到準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果。

3.4 本方法與傳統(tǒng)焦測(cè)序檢測(cè)方法的比較

表3是本實(shí)驗(yàn)方法和傳統(tǒng)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法^{[20，21]}在耗時(shí)和成本方面的比較。本方法以全血作為模板省去了DNA提取過程，從收到樣本到得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可在2 h內(nèi)完成，同時(shí)降低了樣品間交叉污染的可能性; 另外，高靈敏的焦磷酸測(cè)序在保證檢測(cè)準(zhǔn)確性的前提下僅使用0.10 μL全血或3.00 μL PCR產(chǎn)物，與傳統(tǒng)焦磷酸測(cè)序方法相比，成本下降了約40%。

a基因組DNA提取使用QIAamp DNA 血液提取試劑盒。b傳統(tǒng)PCR方法和全血imLATE-PCR方法均使用rTaq DNA 聚合酶。c傳統(tǒng)基于PCR的焦測(cè)序方法單鏈DNA制備使用鏈親和素瓊脂糖球珠。d傳統(tǒng)基于PCR的焦測(cè)序方法采用PyroMark Gold Q24 焦測(cè)序試劑。

a QIAamp DNA Blood Mini Kit （QIAGEN） was used for gDNA extraction. b rTaq DNA polymerase （TaKaRa） was used for conventional PCR and whole blood-imLATE-PCR. c Streptavidin Sepharose beads （GE Healthcare） were used for ssDNA preparation in conventional PCR-based pyrosequencing. d PyroMark Gold Q24 Reagents （QIAGEN） were used for conventional PCR-based pyrosequencing.

4 結(jié) 論

乙醇脫氫酶基因多態(tài)性導(dǎo)致乙醇在不同個(gè)體中的代謝速率不同。研究表明，急性酒精中毒、酒精性肝病、胰腺炎、心腦血管疾病、肝癌以及結(jié)直腸癌等一些癌癥都與乙醇脫氫酶基因多態(tài)性有關(guān)^{[17，18]}。乙醇對(duì)許多腫瘤是一種促癌劑，已有報(bào)道表明乙醇代謝酶基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)^[19]。所以檢測(cè)酒精代謝相關(guān)基因的多態(tài)性，評(píng)估人體酒精代謝能力，可用于預(yù)防與飲酒相關(guān)疾病，對(duì)人類健康有著非常重要的意義。

本研究改進(jìn)了LATE-PCR方法，采用“HpH Buffer”以全血為模板直接擴(kuò)增，建立了全血imLATE-PCR方法，該方法具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、污染少、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，為臨床上檢測(cè)基因多態(tài)性和疾病早期預(yù)警提供了新手段。

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Genotyping of Alcohol Dehydrogenase Gene by Pyrosequencing

Coupled with Improved Linear-after-the-Exponential

Polymerase Chain Reaction Using Human

Whole Blood as Starting Material

XIANG Zheng1， LIU Yun-Long2， XING Xiao-Qing1， CHU Ya-Nan2， SONG Qin-Xin*1，2， ZHOU Guo-Hua1，2

1（Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance of Ministry of Education，

China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

2（Department of Pharmacology， Jinling Hospital， Nanjing University School of Medicine， Nanjing 210002， China）

Abstract Pyrosequencing is one of the important genetic polymorphism detection methods currently， but the complicated pretreatment procedure limits its application in clinical test. To simplify the whole process of pyrosequencing， on the basis of the linear-after-the-exponential-polymerase chain reaction （LATE-PCR）， we improved the primer design method of LATE-PCR， increased the length and the concentration of the excess primer， applied direct amplification technology with whole blood， and established a whole blood-imLATE-PCR method based on common rTaq polymerase and “HpH Buffer” （High pH buffer）. The amplification system was optimized， and the influences of blood anticoagulant and the amount of whole blood template were investigated. The single stranded template for the pyrosequencing was obtained by PCR amplification using a single tube in one-step process， and the alcohol dehydrogenase gene polymorphisms of 24 clinical blood samples were then detected successfully. The results could be used to guide clinical individualized medication. The genotypes of ADH1B locus of 24 samples were 6 cases of AA homozygote， 14 cases of AG heterozygote， and 4 cases of GG homozygote. The genotypes of ADH1C were 20 cases of GG homozygote， 4 cases of AG heterozygote， and no cases of AA homozygote.

Keywords Whole blood-polymerase chain reaction; Linear-after-the-exponential-polymerase chain reaction; Pyrosequencing; Gene polymorphism; Ethanolic metabolism

（Received 6 May 2014; accepted 9 September 2014）endprint