免疫熒光層析定量檢測系統(tǒng)的改進(jìn)研究

張超+劉艷珍

[摘要] 針對韓國i-Chroma免疫熒光分析儀定量檢測系統(tǒng)的光路設(shè)計(jì)、試劑條卡殼、電機(jī)驅(qū)動電路進(jìn)行初步改進(jìn)研究，并介紹了一種兩用的微量取樣方法。初步檢測試驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)系統(tǒng)在大幅降低成本以及優(yōu)化反應(yīng)體積后，并未對檢測準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響，光路及光電池的更換還對檢測精密度指標(biāo)提高提供了技術(shù)支撐。這些改進(jìn)方案為開發(fā)出滿足臨床應(yīng)用需求的新型POCT檢測系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]免疫熒光層析法；熒光檢測光路；層析試劑條卡殼；步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動芯片；微量取樣器

[中圖分類號] TH776 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）23-157-05

免疫熒光層析法是一種基于層析技術(shù)和免疫熒光分析相結(jié)合的快速檢測方法。即將熒光染料顆粒作為示蹤標(biāo)記物用于抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)待測溶液中抗原與試紙條上抗體發(fā)生反應(yīng)后，使用激發(fā)光照射試紙條上檢測區(qū)域根據(jù)敏感物質(zhì)濃度大小而呈現(xiàn)不同的熒光強(qiáng)度，通過與分析物校準(zhǔn)曲線比較即可得到待測溶液中目標(biāo)物質(zhì)濃度的檢測結(jié)果[1-2]。目前國內(nèi)外利用此技術(shù)已相繼研發(fā)出諸如韓國i-Chroma系統(tǒng)等自動化檢測系統(tǒng)[3]，其典型整體結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于具有成本低廉、方便快捷、便于定量等特點(diǎn)，此類干式免疫熒光層析法已被廣泛地應(yīng)用在食品藥品、水質(zhì)監(jiān)測，特別是臨床常規(guī)測定等領(lǐng)域。

通常用于定量檢測，所以熒光強(qiáng)度已經(jīng)超出肉眼可識別范圍，而且熒光檢測波長通常較為單一，檢測時還要過濾掉摻雜在其中的激發(fā)光，所以適用于膠體金類的肉眼可視的，比對標(biāo)準(zhǔn)色卡或RGB圖像分析之類的方法在熒光檢測中并不適用[4-6]。本研究針對韓國i-Chroma系統(tǒng)儀器及配套免疫熒光層析試劑條成本較高，使用過程中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些問題，嘗試著對此檢測系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，著重對光路設(shè)計(jì)、層析試劑條結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、計(jì)算機(jī)控制與信號采集、標(biāo)本取樣與反應(yīng)等進(jìn)行了初步分析探討與優(yōu)化研究。

1 光路設(shè)計(jì)

免疫熒光層析條光學(xué)原理如圖2所示，當(dāng)紅色激發(fā)光照射在層析試劑條上后，結(jié)合的熒光標(biāo)記物從激發(fā)光獲取能量轉(zhuǎn)變而發(fā)出熒光被光學(xué)傳感器接收，光學(xué)傳感器將光信號的強(qiáng)弱轉(zhuǎn)變成為電信號的變化。圖中可見免疫熒光層析試劑條上通常有兩條結(jié)合線，分別為反應(yīng)檢測線與質(zhì)控線，所以其需要在運(yùn)動中進(jìn)行掃描檢測。

在對韓國i-Chroma系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行深入研究基礎(chǔ)上，本研究推出了一種光路設(shè)計(jì)方案（圖3）。此光路設(shè)計(jì)與韓國i-Chroma系統(tǒng)大致相同，都是采用了二向分色片，使得照射到層析試劑條上檢測線的激發(fā)光與被檢測熒光光路在同一位置上，解決了2套光路不同體而導(dǎo)致的位置差異。二向分色片在此結(jié)構(gòu)上的應(yīng)用原理為：右側(cè)的激發(fā)光照射在呈45°角放置的二向分色片上，此時二向分色片相對于激發(fā)光來說即相當(dāng)于反射鏡，所以激發(fā)光經(jīng)二向分色片反射而由一水平光轉(zhuǎn)變?yōu)槌?0°向下的光經(jīng)透鏡聚焦直接照射在光路下方的熒光層析試劑條上。經(jīng)激發(fā)光照射而產(chǎn)生的熒光由下往上經(jīng)過呈45°角放置的二向反射鏡，因?yàn)闊晒馀c激發(fā)光波長不同，所以此時二向反射鏡對于熒光來說相當(dāng)于透明玻璃，使得熒光可以直接穿透二向反射鏡持續(xù)向上經(jīng)透鏡聚焦照射在光學(xué)檢測器上。

檢測熒光的強(qiáng)弱除了與熒光示蹤物結(jié)合數(shù)量有關(guān)也與激發(fā)光強(qiáng)弱有關(guān)，所以此設(shè)計(jì)可以有效的避免因位置差而導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度差異，能更準(zhǔn)確的使熒光光強(qiáng)反映出抗原抗體的結(jié)合強(qiáng)度，而避免激發(fā)光變化所帶來的熒光強(qiáng)度變化干擾。

為了進(jìn)一步降低成本并提高系統(tǒng)檢測的靈敏度，本研究針對韓國i-Chroma系統(tǒng)光路設(shè)計(jì)的兩個地方進(jìn)行改進(jìn)，一個是加長了激發(fā)光陷阱，因?yàn)槎蚍稚m然從原理上說對于激發(fā)光相當(dāng)于反射鏡，但是還是會有少部分激發(fā)光會穿透二向分色鏡在內(nèi)部形成漫反射，而有可能會被上方的熒光檢測傳感器所接收到，這一現(xiàn)象在低強(qiáng)度熒光檢測時尤為明顯，所以加長了激發(fā)光陷阱一則延長了激發(fā)光光程，二則有足夠的空間可以在內(nèi)部填充吸光材料通過這兩個途徑同時作用最大程度的減少漫反射，同時也降低了對二向分色片的技術(shù)要求，從而降低了成本。

另外將熒光檢測傳感器的型號改進(jìn)為日本濱松的S1133，該光電池光譜性能可見圖4。

可見此光電池波長范圍可達(dá)1000nm以上，靈敏度可以高達(dá)0.5A/W，也就是說此光電池的采用可以拓寬熒光示蹤標(biāo)記物的選擇范圍，并且獲得更高的檢測靈敏度。另一個原因，因?yàn)樵摴怆姵氐牟捎檬沟萌∠n國i-Chroma系統(tǒng)光路中光電池前部的光闌小孔的設(shè)計(jì)成為可能，該小孔的目的是因?yàn)樵怆姵仄焚|(zhì)比較普通，為了獲得更好的信噪比而設(shè)置的，但在實(shí)際生產(chǎn)中如此小的光闌生產(chǎn)工藝成本要求較高。本研究因?yàn)楦鼡Q光電池的型號使得生產(chǎn)難度與成本降低，而且取消了光闌使得被檢測熒光可以直接達(dá)到S1133使光通量增大，因此改進(jìn)也提高了本檢測系統(tǒng)的檢測靈敏度。

2 試劑條卡殼設(shè)計(jì)

因?yàn)轫n國i-Chroma系統(tǒng)免疫熒光層析試劑條需要分別檢測兩個不同位置的檢測線（反應(yīng)檢測線與質(zhì)控線），這就需要一套機(jī)械傳動機(jī)構(gòu)來配合光路系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)檢測掃描工作。但是目前免疫熒光層析試劑條卡殼多為如圖5外形。

該類試劑條卡殼外形為長方體，其本身結(jié)構(gòu)并不適合于機(jī)械傳動，所以為配合使其具有光學(xué)掃描功能，通常會設(shè)計(jì)一個試劑條載物臺，然后將試劑條插入到載物臺上，實(shí)際機(jī)械系統(tǒng)是驅(qū)動載物臺進(jìn)行掃描動作，再由載物臺承載試劑條進(jìn)行同步掃描動作。因?yàn)樵噭l卡殼本身沒有什么固定裝置，這就使得配套的試劑載物臺機(jī)械設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，所以本研究在韓國i-Chroma系統(tǒng)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種新型試劑條卡殼，其外形結(jié)構(gòu)如圖6。

在該設(shè)計(jì)上可以看到，前方多出了個試劑條溝槽，使得在機(jī)械設(shè)計(jì)上只要配套一個拉勾就可以實(shí)現(xiàn)試劑條的前后掃描動作。

圖7為試劑條卡殼前視圖，此設(shè)計(jì)不同于一般卡殼之長方形設(shè)計(jì)，而是采用了上下外徑不對等的設(shè)計(jì)預(yù)留了限位槽位置，這樣結(jié)合了溝槽與限位槽就可以取消了應(yīng)用于此POCT設(shè)備中試劑條載物架的要求，從而簡化了機(jī)械部分的復(fù)雜關(guān)系，從而又可以配合檢測光路進(jìn)行免疫熒光層析試劑條的掃描功能。endprint

3 電機(jī)驅(qū)動電路

一個穩(wěn)定高精度的機(jī)械運(yùn)動平臺是免疫熒光層析定量檢測系統(tǒng)掃描采集熒光信號的必要組件。根據(jù)對韓國i-Chroma系統(tǒng)的步進(jìn)電機(jī)電路的研究發(fā)現(xiàn)，它采用的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動芯片為Allegro公司的SLA7024，該芯片為：驅(qū)動二相6線步進(jìn)電機(jī)，最大驅(qū)動電流為1.5A的一個直插驅(qū)動芯片，在對其技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行分析并結(jié)合POCT類儀器小型化的要求后，找出了兩個問題。

一可見該部件電機(jī)的方框圖見圖8。

根據(jù)方框圖可以發(fā)現(xiàn)該芯片為半橋驅(qū)動，電機(jī)驅(qū)動電壓來自與VBB腳所連接的電源，驅(qū)動管只有下拉能力，所以使得其應(yīng)用范圍只能為6線2相步

進(jìn)電機(jī)，而國內(nèi)兩相步進(jìn)電機(jī)多為4線，而且相同技術(shù)指標(biāo)下6線電機(jī)成本比4線電機(jī)高，目前逐步退出市場，原因之一可能是韓國i-Chroma系統(tǒng)因?yàn)樵O(shè)計(jì)上市時間較早的原因，而沒有采用更經(jīng)濟(jì)的應(yīng)用時間相對較晚的2相4線步進(jìn)電機(jī)。

再查技術(shù)指標(biāo)，該芯片只支持2細(xì)分驅(qū)動，也就是說按當(dāng)前主流2相步進(jìn)電機(jī)步距角多為1.8度，2細(xì)分驅(qū)動的情況下最高精度為1.8/2=0.9度。在掃描分析中精細(xì)的掃描精度是需要精密的機(jī)械機(jī)構(gòu)作為支撐的，如果電機(jī)旋轉(zhuǎn)角度精度不高，則需要更為復(fù)雜機(jī)械結(jié)構(gòu)去補(bǔ)足這一缺陷，這也許是韓國i-Chroma系統(tǒng)采用試劑條載物臺機(jī)械結(jié)構(gòu)的原因之一。

針對以上兩點(diǎn)缺點(diǎn)在本研究將驅(qū)動芯片型號改為了日本三洋的LV8731，它的方框圖可見圖9。

在圖上可視每相驅(qū)動管比SLA7024均多了一倍，使其具備上下拉能力，因此該芯片應(yīng)用范圍更廣，既可以使用2相6線電機(jī)也可以使用2相4線電機(jī)，而且無論是配套電機(jī)價格還是芯片價格均比i-Chroma方案低。在細(xì)查該芯片技術(shù)指標(biāo)，該芯片驅(qū)動電流為2A，相當(dāng)于SLA7024驅(qū)動能力1.5A的0.75倍。而且支持8細(xì)分，同樣按照1.8度電機(jī)進(jìn)行計(jì)算，步距角最高可以到1.8/8=0.225度，也就是說在使用同樣電機(jī)的情況下LV8731驅(qū)動的旋轉(zhuǎn)精度是SLA7024的4倍，這樣就更有利于采集到分辨率更高的熒光圖譜，對于免疫熒光層析試劑條來說直接提高了檢測靈敏度。

因此，本研究建議可以使用LV8731芯片直接替換掉SLA7024以提高本檢測系統(tǒng)的機(jī)械技術(shù)指標(biāo)，另外比較了2種芯片的實(shí)際物理尺寸后，LV8731的實(shí)際尺寸遠(yuǎn)小于SLA7024，這樣該芯片的采用不僅提高了機(jī)械技術(shù)指標(biāo)也更有利于POCT類設(shè)備小型化的要求。兩者的物理尺寸圖可參考圖10、11。

4 標(biāo)本上樣

加樣準(zhǔn)確度對于定量免疫分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也是非常重要的因素，而POCT類產(chǎn)品的應(yīng)用除此以外還要求便利性。而目前臨床采用的無論微量移液器還是毛細(xì)采血管均只能考慮準(zhǔn)確性或便利性兩個方面之一。在韓國i-Chroma系統(tǒng)中有一個獨(dú)特的加樣裝置，經(jīng)研究這是一個兼容上述兩種要求的一個不錯的方案。結(jié)構(gòu)圖見圖12。

如圖所示，它的底部為一毛細(xì)管，但中部有漏氣的方形開口，所以當(dāng)它與液體標(biāo)本接觸時，因?yàn)槊?xì)現(xiàn)象會導(dǎo)致標(biāo)本沿吸樣端向上爬升，而毛細(xì)管的內(nèi)徑與長度決定了吸樣量，這樣就簡化了操作過程，增加了便利性，并且吸樣量的精度也得到了保證，當(dāng)將它插入試劑瓶后然后再倒置，如果擠壓試劑瓶瓶內(nèi)試劑可以從滴注端被擠出，所以此取樣器一物兩用，是個不錯的微量取樣設(shè)計(jì)思路值得推薦。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

使用主CPU輸出脈沖驅(qū)動步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，然后通過機(jī)械裝置并結(jié)合試劑條將步進(jìn)電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動轉(zhuǎn)化為直線前后運(yùn)動，在運(yùn)動的同時激發(fā)光持續(xù)點(diǎn)亮照射熒光層析試劑條，光學(xué)傳感器持續(xù)接收將光強(qiáng)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏餍盘枺ㄟ^前置放大器的I/V轉(zhuǎn)換電路將電流信息轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘?，然后由主CPU中內(nèi)置的AD轉(zhuǎn)換器將電壓信號轉(zhuǎn)變?yōu)?6bit數(shù)字信號儲存，然后通過通訊端口將數(shù)字信號上傳至PC機(jī)。

將PC機(jī)收到的數(shù)字信號作為Y軸，因?yàn)閷游鲈噭l為勻速直線運(yùn)動，所以將整個檢測區(qū)間等分為1000等分，將對應(yīng)的1000個Y軸數(shù)據(jù)進(jìn)行描圖繪制即得到圖13熒光分布圖形。

Y軸表示的為熒光強(qiáng)度，單位為RLU（relative light unit），X軸即表示熒光層析試劑條檢測窗掃描范圍的1000個等份。圖上標(biāo)示的三條條豎線左側(cè)兩條間區(qū)域即為反應(yīng)檢測線區(qū)間，右側(cè)兩條間區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控檢測線區(qū)間。

將反應(yīng)檢測線區(qū)間面積疊加結(jié)果通常命名為T峰面積，質(zhì)控檢測線去區(qū)間面積疊加結(jié)果通常命名為C峰面積，然后將T峰面積除以C峰面積得到的即為T/C值，將不同結(jié)合強(qiáng)度的抗原抗體反應(yīng)掃描所得到的T/C值進(jìn)行比較分析，可以用于對本檢測方案之技術(shù)性能指標(biāo)進(jìn)行評估。并且在非檢測線空白區(qū)域沒有出現(xiàn)激發(fā)光干擾現(xiàn)象，空白曲線較為平滑信噪比較高具有實(shí)用檢驗(yàn)價值。

將韓國 i-Chroma系統(tǒng)作為比對系統(tǒng)進(jìn)行分析，本改進(jìn)系統(tǒng)使用韓國i-Chroma 系統(tǒng)的CRP試劑條卡殼中的試劑裸條拆出，放入到本方案的試劑條卡殼中，將英國RANDOX公司的CRP標(biāo)準(zhǔn)物加入到內(nèi)嵌了韓國i-Chroma系統(tǒng)裸條的本改進(jìn)系統(tǒng)試劑條卡殼中，然后使用改進(jìn)的光路進(jìn)行激發(fā)與熒光掃描分別得到對應(yīng)的CRP濃度與T/C值結(jié)果見表1。

由上述結(jié)果可見T/C值與CRP反應(yīng)濃度呈正向相關(guān)，可以通過該檢測裝置所檢測到的熒光RLU值推算出CRP抗原抗體的結(jié)合強(qiáng)度。將CRP濃度與T/C值使用3次多項(xiàng)式法擬合后得到如下求值公式：y=3E-05x3 -0.0034x2+0.1133x-0.4224，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r為 0.9992。

將CRP國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ERM-DA474、CRP質(zhì)控物分別加入韓國i-Chroma系統(tǒng)原裝試劑條與內(nèi)嵌裸條的改進(jìn)系統(tǒng)試劑卡殼中，然后將原裝試劑條使用韓國i-Chroma系統(tǒng)儀器讀數(shù)檢測，本改進(jìn)系統(tǒng)卡殼放入本檢測系統(tǒng)中分別進(jìn)行檢測[4]，所檢測的T/C值帶入上述之3次多項(xiàng)式公式中進(jìn)行結(jié)果換算，ERM-DA474用于準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表2，CRP質(zhì)控物用于精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表3。

從表2可以發(fā)現(xiàn)本改進(jìn)系統(tǒng)在準(zhǔn)確度方面與韓國i-Chroma系統(tǒng)兩者無顯著性差異，均符合一般檢測質(zhì)量技術(shù)要求。精密度方面，從表3可見本改進(jìn)系統(tǒng)對于韓國i-Chroma系統(tǒng)而言，檢測精密度有明顯的改善。

在對韓國i-Chroma系統(tǒng)進(jìn)行深入研究基礎(chǔ)上，本研究通過對免疫熒光層析試劑條的檢測光路、試劑條卡殼、電路、熒光圖譜繪制等進(jìn)行了改進(jìn)與研究，提供了一種客觀合理的分析方法，并且具有一定的實(shí)際使用基礎(chǔ)，這為今后在此基礎(chǔ)之上加入一定的人機(jī)界面、標(biāo)準(zhǔn)曲線儲存等功能，設(shè)計(jì)開發(fā)出一種成熟的基于免疫熒光層析法的快速免疫定量分析儀奠定了一定工作基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2014-10-15）endprint

3 電機(jī)驅(qū)動電路

一個穩(wěn)定高精度的機(jī)械運(yùn)動平臺是免疫熒光層析定量檢測系統(tǒng)掃描采集熒光信號的必要組件。根據(jù)對韓國i-Chroma系統(tǒng)的步進(jìn)電機(jī)電路的研究發(fā)現(xiàn)，它采用的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動芯片為Allegro公司的SLA7024，該芯片為：驅(qū)動二相6線步進(jìn)電機(jī)，最大驅(qū)動電流為1.5A的一個直插驅(qū)動芯片，在對其技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行分析并結(jié)合POCT類儀器小型化的要求后，找出了兩個問題。

一可見該部件電機(jī)的方框圖見圖8。

根據(jù)方框圖可以發(fā)現(xiàn)該芯片為半橋驅(qū)動，電機(jī)驅(qū)動電壓來自與VBB腳所連接的電源，驅(qū)動管只有下拉能力，所以使得其應(yīng)用范圍只能為6線2相步

進(jìn)電機(jī)，而國內(nèi)兩相步進(jìn)電機(jī)多為4線，而且相同技術(shù)指標(biāo)下6線電機(jī)成本比4線電機(jī)高，目前逐步退出市場，原因之一可能是韓國i-Chroma系統(tǒng)因?yàn)樵O(shè)計(jì)上市時間較早的原因，而沒有采用更經(jīng)濟(jì)的應(yīng)用時間相對較晚的2相4線步進(jìn)電機(jī)。

再查技術(shù)指標(biāo)，該芯片只支持2細(xì)分驅(qū)動，也就是說按當(dāng)前主流2相步進(jìn)電機(jī)步距角多為1.8度，2細(xì)分驅(qū)動的情況下最高精度為1.8/2=0.9度。在掃描分析中精細(xì)的掃描精度是需要精密的機(jī)械機(jī)構(gòu)作為支撐的，如果電機(jī)旋轉(zhuǎn)角度精度不高，則需要更為復(fù)雜機(jī)械結(jié)構(gòu)去補(bǔ)足這一缺陷，這也許是韓國i-Chroma系統(tǒng)采用試劑條載物臺機(jī)械結(jié)構(gòu)的原因之一。

針對以上兩點(diǎn)缺點(diǎn)在本研究將驅(qū)動芯片型號改為了日本三洋的LV8731，它的方框圖可見圖9。

在圖上可視每相驅(qū)動管比SLA7024均多了一倍，使其具備上下拉能力，因此該芯片應(yīng)用范圍更廣，既可以使用2相6線電機(jī)也可以使用2相4線電機(jī)，而且無論是配套電機(jī)價格還是芯片價格均比i-Chroma方案低。在細(xì)查該芯片技術(shù)指標(biāo)，該芯片驅(qū)動電流為2A，相當(dāng)于SLA7024驅(qū)動能力1.5A的0.75倍。而且支持8細(xì)分，同樣按照1.8度電機(jī)進(jìn)行計(jì)算，步距角最高可以到1.8/8=0.225度，也就是說在使用同樣電機(jī)的情況下LV8731驅(qū)動的旋轉(zhuǎn)精度是SLA7024的4倍，這樣就更有利于采集到分辨率更高的熒光圖譜，對于免疫熒光層析試劑條來說直接提高了檢測靈敏度。

因此，本研究建議可以使用LV8731芯片直接替換掉SLA7024以提高本檢測系統(tǒng)的機(jī)械技術(shù)指標(biāo)，另外比較了2種芯片的實(shí)際物理尺寸后，LV8731的實(shí)際尺寸遠(yuǎn)小于SLA7024，這樣該芯片的采用不僅提高了機(jī)械技術(shù)指標(biāo)也更有利于POCT類設(shè)備小型化的要求。兩者的物理尺寸圖可參考圖10、11。

4 標(biāo)本上樣

加樣準(zhǔn)確度對于定量免疫分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也是非常重要的因素，而POCT類產(chǎn)品的應(yīng)用除此以外還要求便利性。而目前臨床采用的無論微量移液器還是毛細(xì)采血管均只能考慮準(zhǔn)確性或便利性兩個方面之一。在韓國i-Chroma系統(tǒng)中有一個獨(dú)特的加樣裝置，經(jīng)研究這是一個兼容上述兩種要求的一個不錯的方案。結(jié)構(gòu)圖見圖12。

如圖所示，它的底部為一毛細(xì)管，但中部有漏氣的方形開口，所以當(dāng)它與液體標(biāo)本接觸時，因?yàn)槊?xì)現(xiàn)象會導(dǎo)致標(biāo)本沿吸樣端向上爬升，而毛細(xì)管的內(nèi)徑與長度決定了吸樣量，這樣就簡化了操作過程，增加了便利性，并且吸樣量的精度也得到了保證，當(dāng)將它插入試劑瓶后然后再倒置，如果擠壓試劑瓶瓶內(nèi)試劑可以從滴注端被擠出，所以此取樣器一物兩用，是個不錯的微量取樣設(shè)計(jì)思路值得推薦。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

使用主CPU輸出脈沖驅(qū)動步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，然后通過機(jī)械裝置并結(jié)合試劑條將步進(jìn)電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動轉(zhuǎn)化為直線前后運(yùn)動，在運(yùn)動的同時激發(fā)光持續(xù)點(diǎn)亮照射熒光層析試劑條，光學(xué)傳感器持續(xù)接收將光強(qiáng)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏餍盘?，通過前置放大器的I/V轉(zhuǎn)換電路將電流信息轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘?，然后由主CPU中內(nèi)置的AD轉(zhuǎn)換器將電壓信號轉(zhuǎn)變?yōu)?6bit數(shù)字信號儲存，然后通過通訊端口將數(shù)字信號上傳至PC機(jī)。

將PC機(jī)收到的數(shù)字信號作為Y軸，因?yàn)閷游鲈噭l為勻速直線運(yùn)動，所以將整個檢測區(qū)間等分為1000等分，將對應(yīng)的1000個Y軸數(shù)據(jù)進(jìn)行描圖繪制即得到圖13熒光分布圖形。

Y軸表示的為熒光強(qiáng)度，單位為RLU（relative light unit），X軸即表示熒光層析試劑條檢測窗掃描范圍的1000個等份。圖上標(biāo)示的三條條豎線左側(cè)兩條間區(qū)域即為反應(yīng)檢測線區(qū)間，右側(cè)兩條間區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控檢測線區(qū)間。

將反應(yīng)檢測線區(qū)間面積疊加結(jié)果通常命名為T峰面積，質(zhì)控檢測線去區(qū)間面積疊加結(jié)果通常命名為C峰面積，然后將T峰面積除以C峰面積得到的即為T/C值，將不同結(jié)合強(qiáng)度的抗原抗體反應(yīng)掃描所得到的T/C值進(jìn)行比較分析，可以用于對本檢測方案之技術(shù)性能指標(biāo)進(jìn)行評估。并且在非檢測線空白區(qū)域沒有出現(xiàn)激發(fā)光干擾現(xiàn)象，空白曲線較為平滑信噪比較高具有實(shí)用檢驗(yàn)價值。

將韓國 i-Chroma系統(tǒng)作為比對系統(tǒng)進(jìn)行分析，本改進(jìn)系統(tǒng)使用韓國i-Chroma 系統(tǒng)的CRP試劑條卡殼中的試劑裸條拆出，放入到本方案的試劑條卡殼中，將英國RANDOX公司的CRP標(biāo)準(zhǔn)物加入到內(nèi)嵌了韓國i-Chroma系統(tǒng)裸條的本改進(jìn)系統(tǒng)試劑條卡殼中，然后使用改進(jìn)的光路進(jìn)行激發(fā)與熒光掃描分別得到對應(yīng)的CRP濃度與T/C值結(jié)果見表1。

由上述結(jié)果可見T/C值與CRP反應(yīng)濃度呈正向相關(guān)，可以通過該檢測裝置所檢測到的熒光RLU值推算出CRP抗原抗體的結(jié)合強(qiáng)度。將CRP濃度與T/C值使用3次多項(xiàng)式法擬合后得到如下求值公式：y=3E-05x3 -0.0034x2+0.1133x-0.4224，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r為 0.9992。

將CRP國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ERM-DA474、CRP質(zhì)控物分別加入韓國i-Chroma系統(tǒng)原裝試劑條與內(nèi)嵌裸條的改進(jìn)系統(tǒng)試劑卡殼中，然后將原裝試劑條使用韓國i-Chroma系統(tǒng)儀器讀數(shù)檢測，本改進(jìn)系統(tǒng)卡殼放入本檢測系統(tǒng)中分別進(jìn)行檢測[4]，所檢測的T/C值帶入上述之3次多項(xiàng)式公式中進(jìn)行結(jié)果換算，ERM-DA474用于準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表2，CRP質(zhì)控物用于精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表3。

從表2可以發(fā)現(xiàn)本改進(jìn)系統(tǒng)在準(zhǔn)確度方面與韓國i-Chroma系統(tǒng)兩者無顯著性差異，均符合一般檢測質(zhì)量技術(shù)要求。精密度方面，從表3可見本改進(jìn)系統(tǒng)對于韓國i-Chroma系統(tǒng)而言，檢測精密度有明顯的改善。

在對韓國i-Chroma系統(tǒng)進(jìn)行深入研究基礎(chǔ)上，本研究通過對免疫熒光層析試劑條的檢測光路、試劑條卡殼、電路、熒光圖譜繪制等進(jìn)行了改進(jìn)與研究，提供了一種客觀合理的分析方法，并且具有一定的實(shí)際使用基礎(chǔ)，這為今后在此基礎(chǔ)之上加入一定的人機(jī)界面、標(biāo)準(zhǔn)曲線儲存等功能，設(shè)計(jì)開發(fā)出一種成熟的基于免疫熒光層析法的快速免疫定量分析儀奠定了一定工作基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉婷婷，屈渲婷.熒光免疫層析試劑條定量檢測儀的研制[J].現(xiàn)代電子技術(shù)，2013，36（15）：195-198.

[2] 劉翔，杜民，李玉榕.熒光免疫層析定量檢測系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[J].電子測量與儀器學(xué)報，2013，27（9）：859-866.

[3] 鄧芳梅，林曉文，李德發(fā).i-CHROMA^TM READER免疫熒光分析儀性能評價[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，12（2）：107-109.

[4] 王帥，鄭德智.定量膠體金試劑條濃度檢測方法[J].北京航空航天大學(xué)學(xué)報，2009，35（8）： 942-945.

[5] 何小維，趙喜紅.膠體金快速診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2007，23（1）：86-88.

[6] Kim Suhyeon，Park Je-Kyun.Development of a Test Strip Reader for a Lateral Flow Membrane-based Immuno-chromatographic Assay[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2004，9（2）：127-131.

（收稿日期：2014-10-15）endprint

3 電機(jī)驅(qū)動電路

一個穩(wěn)定高精度的機(jī)械運(yùn)動平臺是免疫熒光層析定量檢測系統(tǒng)掃描采集熒光信號的必要組件。根據(jù)對韓國i-Chroma系統(tǒng)的步進(jìn)電機(jī)電路的研究發(fā)現(xiàn)，它采用的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動芯片為Allegro公司的SLA7024，該芯片為：驅(qū)動二相6線步進(jìn)電機(jī)，最大驅(qū)動電流為1.5A的一個直插驅(qū)動芯片，在對其技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行分析并結(jié)合POCT類儀器小型化的要求后，找出了兩個問題。

一可見該部件電機(jī)的方框圖見圖8。

根據(jù)方框圖可以發(fā)現(xiàn)該芯片為半橋驅(qū)動，電機(jī)驅(qū)動電壓來自與VBB腳所連接的電源，驅(qū)動管只有下拉能力，所以使得其應(yīng)用范圍只能為6線2相步

進(jìn)電機(jī)，而國內(nèi)兩相步進(jìn)電機(jī)多為4線，而且相同技術(shù)指標(biāo)下6線電機(jī)成本比4線電機(jī)高，目前逐步退出市場，原因之一可能是韓國i-Chroma系統(tǒng)因?yàn)樵O(shè)計(jì)上市時間較早的原因，而沒有采用更經(jīng)濟(jì)的應(yīng)用時間相對較晚的2相4線步進(jìn)電機(jī)。

再查技術(shù)指標(biāo)，該芯片只支持2細(xì)分驅(qū)動，也就是說按當(dāng)前主流2相步進(jìn)電機(jī)步距角多為1.8度，2細(xì)分驅(qū)動的情況下最高精度為1.8/2=0.9度。在掃描分析中精細(xì)的掃描精度是需要精密的機(jī)械機(jī)構(gòu)作為支撐的，如果電機(jī)旋轉(zhuǎn)角度精度不高，則需要更為復(fù)雜機(jī)械結(jié)構(gòu)去補(bǔ)足這一缺陷，這也許是韓國i-Chroma系統(tǒng)采用試劑條載物臺機(jī)械結(jié)構(gòu)的原因之一。

針對以上兩點(diǎn)缺點(diǎn)在本研究將驅(qū)動芯片型號改為了日本三洋的LV8731，它的方框圖可見圖9。

在圖上可視每相驅(qū)動管比SLA7024均多了一倍，使其具備上下拉能力，因此該芯片應(yīng)用范圍更廣，既可以使用2相6線電機(jī)也可以使用2相4線電機(jī)，而且無論是配套電機(jī)價格還是芯片價格均比i-Chroma方案低。在細(xì)查該芯片技術(shù)指標(biāo)，該芯片驅(qū)動電流為2A，相當(dāng)于SLA7024驅(qū)動能力1.5A的0.75倍。而且支持8細(xì)分，同樣按照1.8度電機(jī)進(jìn)行計(jì)算，步距角最高可以到1.8/8=0.225度，也就是說在使用同樣電機(jī)的情況下LV8731驅(qū)動的旋轉(zhuǎn)精度是SLA7024的4倍，這樣就更有利于采集到分辨率更高的熒光圖譜，對于免疫熒光層析試劑條來說直接提高了檢測靈敏度。

因此，本研究建議可以使用LV8731芯片直接替換掉SLA7024以提高本檢測系統(tǒng)的機(jī)械技術(shù)指標(biāo)，另外比較了2種芯片的實(shí)際物理尺寸后，LV8731的實(shí)際尺寸遠(yuǎn)小于SLA7024，這樣該芯片的采用不僅提高了機(jī)械技術(shù)指標(biāo)也更有利于POCT類設(shè)備小型化的要求。兩者的物理尺寸圖可參考圖10、11。

4 標(biāo)本上樣

加樣準(zhǔn)確度對于定量免疫分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也是非常重要的因素，而POCT類產(chǎn)品的應(yīng)用除此以外還要求便利性。而目前臨床采用的無論微量移液器還是毛細(xì)采血管均只能考慮準(zhǔn)確性或便利性兩個方面之一。在韓國i-Chroma系統(tǒng)中有一個獨(dú)特的加樣裝置，經(jīng)研究這是一個兼容上述兩種要求的一個不錯的方案。結(jié)構(gòu)圖見圖12。

如圖所示，它的底部為一毛細(xì)管，但中部有漏氣的方形開口，所以當(dāng)它與液體標(biāo)本接觸時，因?yàn)槊?xì)現(xiàn)象會導(dǎo)致標(biāo)本沿吸樣端向上爬升，而毛細(xì)管的內(nèi)徑與長度決定了吸樣量，這樣就簡化了操作過程，增加了便利性，并且吸樣量的精度也得到了保證，當(dāng)將它插入試劑瓶后然后再倒置，如果擠壓試劑瓶瓶內(nèi)試劑可以從滴注端被擠出，所以此取樣器一物兩用，是個不錯的微量取樣設(shè)計(jì)思路值得推薦。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

使用主CPU輸出脈沖驅(qū)動步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，然后通過機(jī)械裝置并結(jié)合試劑條將步進(jìn)電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動轉(zhuǎn)化為直線前后運(yùn)動，在運(yùn)動的同時激發(fā)光持續(xù)點(diǎn)亮照射熒光層析試劑條，光學(xué)傳感器持續(xù)接收將光強(qiáng)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏餍盘?，通過前置放大器的I/V轉(zhuǎn)換電路將電流信息轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘?，然后由主CPU中內(nèi)置的AD轉(zhuǎn)換器將電壓信號轉(zhuǎn)變?yōu)?6bit數(shù)字信號儲存，然后通過通訊端口將數(shù)字信號上傳至PC機(jī)。

將PC機(jī)收到的數(shù)字信號作為Y軸，因?yàn)閷游鲈噭l為勻速直線運(yùn)動，所以將整個檢測區(qū)間等分為1000等分，將對應(yīng)的1000個Y軸數(shù)據(jù)進(jìn)行描圖繪制即得到圖13熒光分布圖形。

Y軸表示的為熒光強(qiáng)度，單位為RLU（relative light unit），X軸即表示熒光層析試劑條檢測窗掃描范圍的1000個等份。圖上標(biāo)示的三條條豎線左側(cè)兩條間區(qū)域即為反應(yīng)檢測線區(qū)間，右側(cè)兩條間區(qū)域?yàn)橘|(zhì)控檢測線區(qū)間。

將反應(yīng)檢測線區(qū)間面積疊加結(jié)果通常命名為T峰面積，質(zhì)控檢測線去區(qū)間面積疊加結(jié)果通常命名為C峰面積，然后將T峰面積除以C峰面積得到的即為T/C值，將不同結(jié)合強(qiáng)度的抗原抗體反應(yīng)掃描所得到的T/C值進(jìn)行比較分析，可以用于對本檢測方案之技術(shù)性能指標(biāo)進(jìn)行評估。并且在非檢測線空白區(qū)域沒有出現(xiàn)激發(fā)光干擾現(xiàn)象，空白曲線較為平滑信噪比較高具有實(shí)用檢驗(yàn)價值。

將韓國 i-Chroma系統(tǒng)作為比對系統(tǒng)進(jìn)行分析，本改進(jìn)系統(tǒng)使用韓國i-Chroma 系統(tǒng)的CRP試劑條卡殼中的試劑裸條拆出，放入到本方案的試劑條卡殼中，將英國RANDOX公司的CRP標(biāo)準(zhǔn)物加入到內(nèi)嵌了韓國i-Chroma系統(tǒng)裸條的本改進(jìn)系統(tǒng)試劑條卡殼中，然后使用改進(jìn)的光路進(jìn)行激發(fā)與熒光掃描分別得到對應(yīng)的CRP濃度與T/C值結(jié)果見表1。

由上述結(jié)果可見T/C值與CRP反應(yīng)濃度呈正向相關(guān)，可以通過該檢測裝置所檢測到的熒光RLU值推算出CRP抗原抗體的結(jié)合強(qiáng)度。將CRP濃度與T/C值使用3次多項(xiàng)式法擬合后得到如下求值公式：y=3E-05x3 -0.0034x2+0.1133x-0.4224，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r為 0.9992。

將CRP國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ERM-DA474、CRP質(zhì)控物分別加入韓國i-Chroma系統(tǒng)原裝試劑條與內(nèi)嵌裸條的改進(jìn)系統(tǒng)試劑卡殼中，然后將原裝試劑條使用韓國i-Chroma系統(tǒng)儀器讀數(shù)檢測，本改進(jìn)系統(tǒng)卡殼放入本檢測系統(tǒng)中分別進(jìn)行檢測[4]，所檢測的T/C值帶入上述之3次多項(xiàng)式公式中進(jìn)行結(jié)果換算，ERM-DA474用于準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表2，CRP質(zhì)控物用于精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表3。

從表2可以發(fā)現(xiàn)本改進(jìn)系統(tǒng)在準(zhǔn)確度方面與韓國i-Chroma系統(tǒng)兩者無顯著性差異，均符合一般檢測質(zhì)量技術(shù)要求。精密度方面，從表3可見本改進(jìn)系統(tǒng)對于韓國i-Chroma系統(tǒng)而言，檢測精密度有明顯的改善。

在對韓國i-Chroma系統(tǒng)進(jìn)行深入研究基礎(chǔ)上，本研究通過對免疫熒光層析試劑條的檢測光路、試劑條卡殼、電路、熒光圖譜繪制等進(jìn)行了改進(jìn)與研究，提供了一種客觀合理的分析方法，并且具有一定的實(shí)際使用基礎(chǔ)，這為今后在此基礎(chǔ)之上加入一定的人機(jī)界面、標(biāo)準(zhǔn)曲線儲存等功能，設(shè)計(jì)開發(fā)出一種成熟的基于免疫熒光層析法的快速免疫定量分析儀奠定了一定工作基礎(chǔ)。

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[3] 鄧芳梅，林曉文，李德發(fā).i-CHROMA^TM READER免疫熒光分析儀性能評價[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，12（2）：107-109.

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[6] Kim Suhyeon，Park Je-Kyun.Development of a Test Strip Reader for a Lateral Flow Membrane-based Immuno-chromatographic Assay[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2004，9（2）：127-131.

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