裂褶菌子實體中多糖及蛋白質(zhì)含量的測定

孫鵬珍+劉月+王大可+李愛欣+王淑敏

[摘要]目的 建立裂褶菌子實體中多糖、蛋白質(zhì)含量的測定方法。 方法 采用分光光度法測定多糖和總蛋白含量，檢測波長分別為479nm和595nm。 結(jié)果 多糖濃度在0.012～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.2631%。 結(jié)論 本研究建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 裂褶菌；多糖；蛋白質(zhì)；含量測定

[中圖分類號] TQ461 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）23-74-04

裂褶菌（Schizophyllum commne Fr.）又稱白參、樹花、八擔(dān)柴，隸屬于真菌門（Eumycophyta），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales），裂褶菌科（Schizophyllaceae），裂褶菌屬（Schizophyllum），食用有滋補、強身的作用[1]。近年來，日本及歐美等國在分子生物學(xué)、抗癌活性物質(zhì)和優(yōu)良菌株的選育等方面進(jìn)行了廣泛的研究[2-4]，我國李夢杰等[5]對其培養(yǎng)研究并分離出了產(chǎn)漆酶的裂褶菌GGHN08-104菌株。裂褶菌子實體中含有多種活性成分，郭孟璧等[6]對裂褶菌揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，結(jié)果鑒定出（Z，Z） -9，12-十八二烯酸等12種化學(xué)成分，毛紹春等[7]用硅膠柱反復(fù)層析從子實體中分離出了麥角甾醇等多種化合物。藥用真菌目前研究最多的是真菌多糖，裂褶菌多糖可增強巨噬細(xì)胞的吞噬活性，對巨噬細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞有激活作用，能提高白細(xì)胞介素產(chǎn)生能力[8]，對體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2、Bel-7402及喉癌Hep-2細(xì)胞的生長繁殖具有顯著的抑制作用[9]，所以其子實體中多糖含量可以作為裂褶菌食藥用價值高低的指標(biāo)之一。王鳳仙等[10]測定出裂褶菌子實體中含有15種氨基酸，趙琪等[11]綜述裂褶菌能產(chǎn)生多種酶，所以對其蛋白質(zhì)含量測定也可以衡量其食藥用價值的高低。本研究建立了裂褶菌子實體中多糖和蛋白含量的測定方法，具有一定的理論和實際意義。

1 儀器與材料

紫外-可見分光光度計（UV2450日本島津），葡萄糖對照品、牛血清蛋白對照品（購于北京索萊寶科技有限公司），裂褶菌子實體（采于長春中醫(yī)藥大學(xué)校園）。

2 方法與結(jié)果

2.1 子實體多糖含量的測定[12]

采用3，5—二硝基水楊酸定糖法測定裂褶菌子實體中多糖的含量。

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25mg，置25mL容量瓶中加水定容至刻度，即得1mg/mL葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：精密稱取子實體粉末2.5081g，加熱回流提取3次，每次30min，合并濾液并濃縮，定容至50mL量瓶中，即得。作為總糖供試品和還原糖供試品備用。（2）總糖供試液的制備：精密量取供試品溶液2mL，置25mL容量瓶中，加6N鹽酸8mL，置沸水浴加熱30min，冷卻，加1滴酚酞指示劑，用40%氫氧化鈉溶液中和至微紅色，加水定容至刻度，即得總糖供試液。（3）還原糖供試液制備：即為上述供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取葡萄糖標(biāo)品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL分別置于25mL容量瓶中，均加蒸餾水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容至刻度，搖勻。479nm波長下測定樣品吸光值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，葡萄糖在0.0120～0.0400mg/mL范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.2 精密度試驗 取葡萄糖對照品溶液0.7mL，置于25mL量瓶中，加蒸餾水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容至刻度，搖勻。479nm波長下連續(xù)測定6次吸光度值，RSD值為0.5981%。表明儀器精密度良好。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，加水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容至刻度，搖勻。置于479nm波長下，分別于0、0.5、1.0、1.5、2h 測定吸光度。其RSD值為0.7197%，表明供試品溶液在2h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.4 重復(fù)性試驗 取同一子實體樣品5份，分別按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別取1mL，置于25mL量瓶中，加蒸餾水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容，搖勻。置于479nm波長下測定吸光度值。其RSD值為1.0752%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗 稱取已知總糖含量的子實體粉末6份，每份約1.25 g，精密稱取，分別精密加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，按照“2.1.2”項下制備方法制得續(xù)濾液，依法分別測總糖含量，計算加樣回收率。實驗數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果表明，本方法葡萄糖加樣回收率RSD為0.41%，說明該方法測定裂褶菌子實體糖的含量穩(wěn)定可靠。

2.1.4 樣品含量測定 按3，5-二硝基水楊酸定糖法對樣品中總糖和還原糖進(jìn)行測定，總糖減去還原糖即為多糖含量。計算出裂褶菌子實體中多糖的含量為7.26%。見表2。

2.2 蛋白質(zhì)的含量測定[13-15]endprint

采用考馬斯亮藍(lán)法測定裂褶菌子實體中蛋白質(zhì)的含量。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制 精密稱定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，即得2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取子實體粉末5.0082g，加8倍量生理鹽水浸漬24h，濾液透析濃縮，定容至10mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于試管中，分別加生理鹽水至0.2mL，再加入考馬斯亮藍(lán)試劑10mL，混勻，5min后于595nm波長下測定其吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白質(zhì)在0.0078～0.0312mg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度，重復(fù)6次，其RSD值為0.5142%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，按照測定法每間隔5min測定其在595nm波長下吸光度，測定20min內(nèi)吸光度值的變化，其RSD值為0.5920%，表明樣品溶液在20min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗 取子實體粉末6份，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度值，其RSD值為1.0867%，表明該方法測定蛋白質(zhì)含量重復(fù)性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取已知蛋白質(zhì)含量的子實體粉末6份，每份約2.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品溶液制備方法得續(xù)濾液，依法測定吸光度，計算回收率，實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.2.3.6 樣品含量測定 對供試品溶液進(jìn)行測定，按照2.2.2項下操作，平行3份，測定其吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量，子實體中總蛋白含量為0.26%，結(jié)果見表4。

3 討論

裂褶菌子實體中多糖濃度在0.0120～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.26%；本研究建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。多糖有提高免疫力等多種良好的藥理作用，所以具有良好的研究與開發(fā)前景，本實驗為開發(fā)新型藥物提供了理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科技技術(shù)出版社，2000：79.

[2] 陳慧芳.植物活性成分辭典（第一冊）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2000.

[3] 胡德群，胡鳴.裂褶菌多糖的研究[J].四川中草藥研究，1994（36）：21-23.

[4] 朱泉娣.裂褶菌子實體無機元素分析[J].中草藥，1986，17（8）：17-18.

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[6] 郭孟璧，田茂軍，李聰，等.裂褶菌揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

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[9] 宋愛榮，王光遠(yuǎn)，趙晨，等.裂褶菌多糖體外抑瘤試驗[R].全國藥用真菌學(xué)術(shù)研討會論文集，2008：224.

[10] 王鳳仙，夏志俊，江月仙，等.不同來源的裂褶菌子實體及發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中氨基酸與無機元素分析[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1989，6（1）：18-20.

[11] 趙琪，袁理春，李榮春.裂褶菌研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報，2004，11（1）：59-63.

[12] 王麗娜，陳水鈁，張兵，等. 3，5一二硝基水楊酸法測定多糖含量的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，張推庭，曾偉，等.應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學(xué)雜志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍(lán)法測定微量蛋白的條件探討[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.雙縮脲法與考馬斯亮藍(lán)法測定母乳總蛋白的應(yīng)用比較[J].臨床檢驗雜志，1997，15（2）：108.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

采用考馬斯亮藍(lán)法測定裂褶菌子實體中蛋白質(zhì)的含量。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制 精密稱定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，即得2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取子實體粉末5.0082g，加8倍量生理鹽水浸漬24h，濾液透析濃縮，定容至10mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于試管中，分別加生理鹽水至0.2mL，再加入考馬斯亮藍(lán)試劑10mL，混勻，5min后于595nm波長下測定其吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白質(zhì)在0.0078～0.0312mg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度，重復(fù)6次，其RSD值為0.5142%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，按照測定法每間隔5min測定其在595nm波長下吸光度，測定20min內(nèi)吸光度值的變化，其RSD值為0.5920%，表明樣品溶液在20min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗 取子實體粉末6份，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度值，其RSD值為1.0867%，表明該方法測定蛋白質(zhì)含量重復(fù)性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取已知蛋白質(zhì)含量的子實體粉末6份，每份約2.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品溶液制備方法得續(xù)濾液，依法測定吸光度，計算回收率，實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.2.3.6 樣品含量測定 對供試品溶液進(jìn)行測定，按照2.2.2項下操作，平行3份，測定其吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量，子實體中總蛋白含量為0.26%，結(jié)果見表4。

3 討論

裂褶菌子實體中多糖濃度在0.0120～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.26%；本研究建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。多糖有提高免疫力等多種良好的藥理作用，所以具有良好的研究與開發(fā)前景，本實驗為開發(fā)新型藥物提供了理論依據(jù)。

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[8] 李兆蘭.裂褶菌多糖的結(jié)構(gòu)研究[J].南京大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋愛榮，王光遠(yuǎn)，趙晨，等.裂褶菌多糖體外抑瘤試驗[R].全國藥用真菌學(xué)術(shù)研討會論文集，2008：224.

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[11] 趙琪，袁理春，李榮春.裂褶菌研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報，2004，11（1）：59-63.

[12] 王麗娜，陳水鈁，張兵，等. 3，5一二硝基水楊酸法測定多糖含量的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，張推庭，曾偉，等.應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學(xué)雜志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍(lán)法測定微量蛋白的條件探討[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.雙縮脲法與考馬斯亮藍(lán)法測定母乳總蛋白的應(yīng)用比較[J].臨床檢驗雜志，1997，15（2）：108.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

采用考馬斯亮藍(lán)法測定裂褶菌子實體中蛋白質(zhì)的含量。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制 精密稱定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，即得2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取子實體粉末5.0082g，加8倍量生理鹽水浸漬24h，濾液透析濃縮，定容至10mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于試管中，分別加生理鹽水至0.2mL，再加入考馬斯亮藍(lán)試劑10mL，混勻，5min后于595nm波長下測定其吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白質(zhì)在0.0078～0.0312mg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度，重復(fù)6次，其RSD值為0.5142%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，按照測定法每間隔5min測定其在595nm波長下吸光度，測定20min內(nèi)吸光度值的變化，其RSD值為0.5920%，表明樣品溶液在20min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗 取子實體粉末6份，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度值，其RSD值為1.0867%，表明該方法測定蛋白質(zhì)含量重復(fù)性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取已知蛋白質(zhì)含量的子實體粉末6份，每份約2.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品溶液制備方法得續(xù)濾液，依法測定吸光度，計算回收率，實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.2.3.6 樣品含量測定 對供試品溶液進(jìn)行測定，按照2.2.2項下操作，平行3份，測定其吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量，子實體中總蛋白含量為0.26%，結(jié)果見表4。

3 討論

裂褶菌子實體中多糖濃度在0.0120～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.26%；本研究建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。多糖有提高免疫力等多種良好的藥理作用，所以具有良好的研究與開發(fā)前景，本實驗為開發(fā)新型藥物提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2014-09-11）endprint