?？莆锓Nβ－酪蛋白基因的研究進(jìn)展

薛 杰，苗永旺

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

?？苿?dòng)物乳中各成分的含量比較穩(wěn)定，乳蛋白約占乳中干物質(zhì)的90%。乳蛋白通常分為兩大類，一類是酪蛋白，主要包括αs1－酪蛋白（CSN1S1）、αs2－酪蛋白（CSN1S2）、β－酪蛋白（Beta－casein，CSN2）、γ酪蛋白和k－酪蛋白（CSN3），其中γ酪蛋白是β酪蛋白的水解片段；另一類為乳清蛋白，包括α－乳清蛋白和β－乳球蛋白以及少量的乳鐵蛋白。哺乳動(dòng)物乳汁中蛋白質(zhì)含量為30～35g／L，一頭奶牛每天可以產(chǎn)乳蛋白1kg，一只奶山羊可產(chǎn)乳蛋白200g。牛奶含氮物在（pH＝4.6）等電點(diǎn)沉淀的部分即為酪蛋白。酪蛋白是牛羊奶中的主要蛋白質(zhì)，占奶總蛋白質(zhì)的80%，乳中主要的酪蛋白是CSN1S1和CSN2。普通牛奶中CSN2約占全酪蛋白的35%［1］，僅次于CSN1S1，而CSN2在山羊和人乳中的含量為最高，在山羊奶中占到酪蛋白的54%以上，在人奶中則達(dá)到70%。CSN2在奶牛乳中含量約為9g／L；水牛奶中約為14.2g／L；在山羊乳中約為10g／L［2］。

β－酪蛋白在各種哺乳動(dòng)物的乳汁中都占有相當(dāng)大的比例，且都是其主要的蛋白質(zhì)。這表明在泌乳激素的刺激下，β－酪蛋白基因具有很強(qiáng)的表達(dá)活性。因此，深入探討β－酪蛋白基因，對(duì)推動(dòng)動(dòng)物產(chǎn)奶性狀的選育和轉(zhuǎn)基因藥物的開發(fā)具有重要的意義。

1 CSN2生物學(xué)特性及其合成機(jī)制

酪蛋白是典型的含磷蛋白質(zhì)，為白色無(wú)味物質(zhì)，也是形成牛乳白色狀的主要成分。酪蛋白分子具有親水性層和疏水性層雙重特性，為兩性分子。酪蛋白在動(dòng)物乳腺中高水平表達(dá)，在乳中以微團(tuán)形式存在，其主要作用是可與Ca2＋形成螯合物，并轉(zhuǎn)運(yùn)至新生兒的骨骼中促進(jìn)骨骼的發(fā)育。酪蛋白含有幾乎全部的必需氨基酸，尤其富含脯氨酸，它是幼年家畜中最具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)，并在腸中礦物質(zhì)（Ca、P、Zn、Fe、Na等）的吸收、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)控等方面也有重要的作用［3］。β－酪蛋白為牛科物種乳蛋白中含量較高的蛋白質(zhì)，是在哺乳期通過產(chǎn)生類固醇激素刺激乳腺分泌合成的，CSN2與其它3 種酪蛋白在乳中以酪蛋白膠團(tuán)的形式存在，成膠體狀，具有較強(qiáng)的疏水性，β－酪蛋白在普通牛中分子重約為25.147KDa，常溫下微溶于水，等電點(diǎn)為5.430，在中性環(huán)境下（pH＝7），電荷量為－6.088。β－酪蛋白相比其他酪蛋白含有大量的脯氨酸殘基，不含半胱氨基酸殘基，N－末端帶負(fù)電荷，且在其附近形成了主要的磷酸化作用位點(diǎn)。CSN2基因是酪蛋白基因家族中的一員，CSN2 與CSN1S1 和CSN1S2 統(tǒng)稱為鈣敏感蛋白，可與磷酸鈣形成穩(wěn)定完整的微膠粒而提高乳中鈣、磷含量。除此之外，CSN2可用于奶酪的制做，并且對(duì)牛、羊乳的凝固發(fā)揮著重要的作用。乳中CSN2 含量穩(wěn)定，因此，可以利用乳中CSN2的含量來(lái)檢測(cè)牛、羊乳樣品是否摻假［4］。

乳腺是合成蛋白質(zhì)十分活躍的場(chǎng)所，乳蛋白編碼基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。除此之外，乳蛋白基因的表達(dá)還受神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控。CSN2與其他乳蛋白合成機(jī)制相同，對(duì)于乳蛋白的合成機(jī)制，Boisgard等［5］于2000年做了研究。乳蛋白首先是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上開始運(yùn)作，然后由信號(hào)肽引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，接著與高爾基體短暫結(jié)合，且在轉(zhuǎn)運(yùn)前集中于高爾基體后的分泌囊泡。未成熟的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行磷酸化和糖基化等化學(xué)修飾過程，再由高爾基體分泌囊泡轉(zhuǎn)送至上皮細(xì)胞頂膜，此期間即形成酪蛋白。近年來(lái)研究表明，JAK2－STAT5、AKT1－mTOR信號(hào)途徑是乳蛋白的重要信號(hào)途徑，從基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成水平調(diào)控乳成分的合成與分泌。Zhou 等［6］2008年研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)GHR 和STAT5基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行超表達(dá)，放大生長(zhǎng)激素的作用，β－酪蛋白的mRNA 表達(dá)上升，證實(shí)生長(zhǎng)激素可通過STAT5影響乳蛋白的表達(dá)。Hayashi等［7］在2009年報(bào)道了通過對(duì)奶牛皮下注射生長(zhǎng)激素，β－酪蛋白產(chǎn)量與對(duì)照組相比明顯上升，試驗(yàn)結(jié)果表明生長(zhǎng)激素可刺激mTOR 信號(hào)通路使其激活。同樣IGF－1R 激活A(yù)KT1－mTOR信號(hào)途徑，也使牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白的合成增加。

2 ?？莆锓NCSN2基因結(jié)構(gòu)

2.1 普通牛CSN2基因結(jié)構(gòu)

Stewart和Jimenez－Flores等在1987年確定了普通牛CSN2＊A2型的cDNA 序列，Bonsing等［8］于1988年確定了普通牛CSN2＊A2 型的基因序列［8］。在普通牛中，CSN2 基因（登錄號(hào)：AC＿000163）全長(zhǎng)8 693bp，共包含9 個(gè)外顯子，8 個(gè)內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。牛CSN2基因9個(gè)外顯子長(zhǎng)度范圍為24～498bp，外顯子1的前123bp位于5′UTR 區(qū)，外顯子2至外顯子7的長(zhǎng)度分別為63bp、27bp、27bp、24bp、42bp和498bp，外顯子8的后36bp和外顯子9的全部位于3′UTR 區(qū)，其中外顯子7 長(zhǎng)498 bp，占整個(gè)編碼區(qū)約70%。CSN2的8個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度范圍為91～1 956bp，內(nèi)含子1至內(nèi)含子8 分別為1 956bp、727bp、112bp、1 893bp、9 1bp、1 3 2 1bp、6 0 1bp和7 3 0bp。在此CSN2基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)存在多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如STAT（MGF）、C／EBP、CAAT box與TATA box等。CSN2基因（登錄號(hào)：M55158）CDS區(qū)長(zhǎng)675bp，編碼一條由224個(gè)氨基酸組成的成熟多肽鏈，其中前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。該基因編碼區(qū)包含24.15% A、20.14% G、25.04%T、30.67%C，其中 AT 含量為49.19%，CG 為50.81%，解鏈溫度為84.99。

圖1 普通牛CSN2基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 CSN2gene structure map of ordinary ox

2.2 水牛CSN2基因結(jié)構(gòu)

水牛CSN2的cDNA 序列于1998年公布，而它的基因序列于2009年在意大利地中海水牛中被報(bào)道［9］。水牛CSN2 基因全長(zhǎng)10.2kb，基因結(jié)構(gòu)與普通牛相似，也由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，水牛CSN2基因各外顯子長(zhǎng)度與普通牛相比一樣，內(nèi)含子略有不同，5′UTR區(qū)與3′UTR 區(qū)序列長(zhǎng)度也相似，所有剪切位點(diǎn)都遵隨5′GT／3′AG 法則。水牛CSN2的cDNA 序列（登錄號(hào)：DQ631829）包含23.85%A、20.59%G、24.89%T 和30.67%C，其中AT 含量為48.74%，GC 為51.26%，解鏈溫度為85.18。

2.3 山羊CSN2基因結(jié)構(gòu)

王強(qiáng)等［10］于2001年公布了山羊的CSN2的全基因序列。山羊CSN2基因全長(zhǎng)13 671bp，基因結(jié)構(gòu)與普通牛和水牛相似，也由9個(gè)外顯子，8個(gè)內(nèi)含子組成。其中第1、第7和第9外顯子長(zhǎng)度與普通牛和水牛略有不同，其它外顯子長(zhǎng)度都相同，山羊第1、第7和第9外顯子長(zhǎng)度分別為48bp、495bp和323bp。山羊CDS序列（登錄號(hào)：AF409096）堿基組成為24.70%A、20.54%G、24.85%T 和29.91%C，AT 含量為49.55%，GC50.45%，解鏈溫度為84.84。

目前，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中可檢索到普通牛、水牛、山羊、綿羊、羊駝等?？莆锓N及人、長(zhǎng)臂猿、猩猩、駱駝、家豬、獼猴、兔子和小鼠等哺乳動(dòng)物的CSN2基因序列，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)牛科物種間序列一致性較高，普通牛與水牛相似度高達(dá)98%，而與其他?？莆锓N和哺乳動(dòng)物的CSN2 氨基酸序列相似度約為96%。在不同物種中，CSN2的氨基酸數(shù)量組成存在差異，這種差異可能是由于種間水平的差異造成的。

3 ?？莆锓NCSN2基因變異

3.1 普通牛中發(fā)現(xiàn)的CSN2基因變異類型

迄今，在普通牛CSN2基因中發(fā)現(xiàn)13種不同的遺傳變體，分別為A1，A2，A3，A4，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H1，H2，I。在奶牛中，CSN2 類型最常見的形式為A1和A2，而B 型是很少見的，A3 和C 是更少見［8］，CSN2＊A2類型是原有的形式，為定義其他類型的參考蛋白。A4等位基因雖然已在韓國(guó)本地牛群中發(fā)現(xiàn)，但是以A2為參考蛋白的替換，目前還不清楚。Eigel等［1］于1984年闡述了CSN2的7個(gè)等位基因A1、A2、A3、B、C、D、E，即A1 蛋白為原有A2型肽鏈的67 位Pro→His替換導(dǎo)致的變異體；A3蛋白為A2型的106位His→Gln替換；B 蛋白在保持A1 蛋白的基礎(chǔ)上，為122 位發(fā)生了Ser→Arg替換；C蛋白也同樣發(fā)生在A1蛋白的基礎(chǔ)上，35位的絲氨酸發(fā)生了去磷酸化（SerP→Ser），同時(shí)37位發(fā)生了Glu→Lys替換；D 蛋白是A2型的18位發(fā)生了SerP→Lys改變；E 型則為A2型的36位Glu 替換為L(zhǎng)ys。Visser 等［11］于1995年發(fā)現(xiàn)了CSN2＊F，該蛋白是在A1型變體的基礎(chǔ)上，152位氨基酸發(fā)生了Pro→Leu替換。Dong和Ng－Kwai－Hang［12］在1998年發(fā)現(xiàn)了CSN2＊G，它和CSN2＊F變異相似，但在137或138位發(fā)生了Pro→Leu替換。Han等［13］在2000年發(fā)現(xiàn)了CSN2＊H 有2個(gè)突變，命名為H1型，為A2型的25位發(fā)生了Arg→Cys替換，88位發(fā)生Leu→Ile替換；Senocq等［14］于2002年發(fā)現(xiàn)了另一種H 型突變，命名為H2，它不同于H1型，為A2型的72位發(fā)生Gln→Glu替換，93位發(fā)生Met→Leu替換和在114與169間發(fā)生了Gln→Glu 的替換。Jann 等［15］于2002年發(fā)現(xiàn)了I型變異體，它僅僅包含H2 型的93 位氨基酸發(fā)生Met→Leu 替換。Givens等［16］2013年在英國(guó)零售牛奶研究中發(fā)現(xiàn)CSN2基因有A1、A2、B、C 等4種變異類型。

3.2 水牛中發(fā)現(xiàn)的CSN2基因變異

有關(guān)水牛的CSN2 基因變異很少被報(bào)道。Bhattacharya等［17］于2008年報(bào)道了水牛CSN2基因和普通牛相比有6個(gè)氨基酸改變，分別為第4位、第56位、第83位、第107位、第121位和第163位氨基酸發(fā)生了His→Arg、Met→Thr、Lys→Asn、Ile→Val、His→Gln 和Pro→His替換；Cosenza等［9］于2009年報(bào)道了意大利地中海水牛的CSN2基因結(jié)構(gòu)，通過比較所獲得外顯子的序列與已發(fā)表的水牛序列，發(fā)現(xiàn)存在13個(gè)突變，其中3個(gè)為非同義突變，發(fā)生在外顯子7的第20，78，179核苷酸位點(diǎn)，分別為T→A（Ile→Asn）替換，G→C（Lys→Asn）替換和T→C（Met→Thr）替換。Vinesh等［18］2013年發(fā)現(xiàn)在水牛CSN2基因外顯子7存在2個(gè)單倍型和啟動(dòng)子區(qū)有4個(gè)單倍型。

3.3 山羊中發(fā)現(xiàn)的CSN2基因變異類型

截至目前，在山羊CSN2基因中發(fā)現(xiàn)9個(gè)等位基因，分別為A、A1、B、C、C1、D、E、0、01。其中A、A1、C、C1、E、0和01等7個(gè)是在DNA 水平發(fā)現(xiàn)的，B和D2個(gè)類型由蛋白質(zhì)水平檢出。山羊的CSN2＊A 型基因?yàn)槎x所有突變類型的參考序列。Mahe等［19］在1993年通過等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)了CSN2＊B 型基因的突變；Neveu等［20］于2002年發(fā)現(xiàn)了0和01兩個(gè)不同的等位基因，CSN2＊0型為A 型基因外顯子7在5′端一個(gè)核苷酸的缺失所導(dǎo)致，CSN2＊01為A 型基因外顯子7的一個(gè)C→T 核苷酸替換（125 位密碼子）產(chǎn)生終止密碼，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止；Galliano等［21］在2004年報(bào)道了CSN2＊D型基因的突變；Cosenza等［22］于2005年在山羊中檢測(cè)出了一個(gè)等位基因CSN2＊A1，它是在外顯子9的第180位核苷酸發(fā)生了C→T 轉(zhuǎn)換；Chessa等［23］于2005年發(fā)現(xiàn)在A型基因外顯子7上第135位核苷酸有C→T 的轉(zhuǎn)換，氨基酸替換為Ala→Val，該變異命名為CSN2＊C型基因；Caroli等［24］在2006年檢測(cè)出了等位基因CSN2＊E，它發(fā)生在A 型基因外顯子7上第124位核苷酸C→A 的轉(zhuǎn)換，即該A 型蛋白166位氨基酸的Ser→Tyr 替換；Chessa等［25］于2008年又發(fā)現(xiàn)了等位基因CSN2＊C1，它是在CSN2＊C基因的基礎(chǔ)上，外顯子9的第60位核苷酸發(fā)生C→T的替換。

4 CSN2基因與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性

CSN2基因在牛科物種中有多種變異類型，國(guó)外學(xué)者對(duì)CSN2 基因與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)研究已有一些報(bào)道，然而國(guó)內(nèi)還未曾見有相關(guān)研究的報(bào)道。該蛋白現(xiàn)已經(jīng)在普通牛與山羊中有一些研究報(bào)道，但在水牛中的研究報(bào)道很少。近年來(lái)關(guān)于CSN2基因與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)研究如表1所示。

5 CSN2基因研究的問題及其展望

眾多研究結(jié)果表明，CSN2基因與?？莆锓N的生產(chǎn)性狀存在一定的相關(guān)性，但當(dāng)前在CSN2基因的研究和應(yīng)用中仍存在一些不足，在未來(lái)亟待進(jìn)一步解決：①在牛科物種的研究中涉及水牛和綿羊等物種較少，應(yīng)加強(qiáng)此類動(dòng)物的研究；②影響?？莆锓N泌乳性狀的各基因之間存在連鎖，有些與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)可能是由于CSN2連鎖基因的效應(yīng)而并非它本身的效應(yīng)，因此在接下來(lái)的工作中需闡明此影響機(jī)制；③多數(shù)研究針對(duì)于牛科物種基因編碼區(qū)的變異檢測(cè)，而對(duì)其5′端、3′端和內(nèi)含子等區(qū)域的調(diào)控機(jī)制研究較少，可加強(qiáng)這方面研究，以解析其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制；④對(duì)CSN2的探索多集中于基因變異的檢測(cè)，而對(duì)基因的磷酸化水平、糖基化程度、轉(zhuǎn)錄后水平的修飾等研究較少，應(yīng)加強(qiáng)此方面的研究；⑤有關(guān)CSN2基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。

表1 CSN2基因與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)研究Table 1 CSN2Gene associated with production traits

?？莆锓Nβ－酪蛋白作為乳中重要的酪蛋白之一，對(duì)乳的理化特性和品質(zhì)具有重要影響。同時(shí)，CSN2在乳的營(yíng)養(yǎng)功能方面扮演重要角色。目前，對(duì)一些?？莆锓NCSN2 基因多態(tài)性已有一些研究報(bào)道，但對(duì)CSN2 基因的變異、表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其多態(tài)性與生產(chǎn)性狀、奶制品品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性等研究的還不充分，急需深入研究，為奶用性狀的遺傳改良提供分子基礎(chǔ)。

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