超微七味白術(shù)散對(duì)腸道厭氧微生物代謝多樣性的調(diào)控作用

王春暉,張華玲,張祺玲,尹抗抗,胡汝曉,譚周進(jìn),*

1 湖南省食用菌研究所, 長(zhǎng)沙 410013 2 湖南省珍貴瀕危藥材工程研究中心, 長(zhǎng)沙 410007 3 湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所, 長(zhǎng)沙 410125 4 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 長(zhǎng)沙 410208

超微七味白術(shù)散對(duì)腸道厭氧微生物代謝多樣性的調(diào)控作用

王春暉1,4,張華玲2,張祺玲3,尹抗抗4,胡汝曉1,譚周進(jìn)4,*

1 湖南省食用菌研究所, 長(zhǎng)沙 410013 2 湖南省珍貴瀕危藥材工程研究中心, 長(zhǎng)沙 410007 3 湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所, 長(zhǎng)沙 410125 4 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 長(zhǎng)沙 410208

探討超微七味白術(shù)散對(duì)菌群失調(diào)腹瀉的腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)作用。采用同時(shí)灌胃頭孢拉定和硫酸慶大霉素進(jìn)行小鼠菌群失調(diào)造模,灌胃給藥七味白術(shù)散傳統(tǒng)湯藥和超微七味白術(shù)散1/2劑量的湯藥進(jìn)行治療,正常組和模型組灌胃等量的無(wú)菌水,治療3 d后,提取腸道微生物,在厭氧條件下,運(yùn)用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)研究腸道微生物的代謝情況。培養(yǎng)72 h時(shí),各組的顏色平均變化率(AWCD)趨于穩(wěn)定,且1/2劑量的超微湯藥治療組>正常組>傳統(tǒng)湯藥治療組>模型組；正常組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)為最大,且與其他各組差異極顯著(P<0.01),1/2劑量超微湯藥治療組的Shannon均勻度和Mclntosh指數(shù)最大,Shannon均勻度與正常組差異不顯著(P>0.05),其余指標(biāo)與各組都存在顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。聚類分析和主成分分析表明抗生素的抑菌作用明顯,使小鼠腸道微生物的代謝受到影響,七味白術(shù)散傳統(tǒng)湯藥和1/2劑量超微湯藥的調(diào)控使小鼠腸道微生物的代謝多樣性逐漸恢復(fù)平衡,但兩種湯藥的調(diào)控作用不盡相同。七味白術(shù)散超微飲片1/2劑量對(duì)腸道厭氧微生物代謝多樣性的調(diào)控作用優(yōu)于傳統(tǒng)飲片。

超微中藥；七味白術(shù)散；Biolog-Eco；代謝多樣性；腸道厭氧微生物

目前已知健康人腸道內(nèi)棲息著約1014多個(gè)微生物,是人體細(xì)胞總數(shù)的10—20倍,約1000種[1]。其中90%—99.9%是厭氧菌,在這些細(xì)菌中主要包括類桿菌屬、真桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬等至少14個(gè)菌屬。雙歧桿菌是人和動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系中的一種非常重要的正常厭氧菌,在機(jī)體腸道內(nèi)發(fā)揮很重要的生理作用,對(duì)維持腸道菌群平衡、治療腸道功能紊亂、控制內(nèi)毒素產(chǎn)生及促進(jìn)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有重要影響[2-3]。乳酸桿菌既可以補(bǔ)充腸道的正常菌群,又能促進(jìn)有益菌的增殖,且對(duì)病原菌有明顯的生物頡抗作用,對(duì)腸道健康有著不可低估的積極影響[4]。酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)抑制艱難梭菌(Clostridiumdifficile)等病原菌的生長(zhǎng)繁殖,促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌的生長(zhǎng)繁殖,加強(qiáng)腸道黏膜營(yíng)養(yǎng)代謝,保護(hù)受損的黏膜屏障,用作微生態(tài)制劑具有很好的療效[5]。大量的研究結(jié)果表明,腸道內(nèi)的厭氧菌對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫功能、營(yíng)養(yǎng)、發(fā)病機(jī)制、健康等起著重要的作用。

中藥成分通過(guò)人體腸道菌群的水解和還原反應(yīng)被轉(zhuǎn)化,降低或消除其毒副作用,對(duì)提高藥效,改變藥用功能意義重大[6]。有些中藥可能必須通過(guò)人體腸道菌群的代謝后才能發(fā)揮作用[7]。代謝產(chǎn)物的質(zhì)變和量變是生物體受基因型與環(huán)境的雙重影響,它們的種類和數(shù)量變化被視為生物系統(tǒng)對(duì)基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)[8-9]。深入研究口服中藥對(duì)人體腸道微生物代謝多樣性的影響,有助于闡明中藥的療效機(jī)理,并為利用腸道微生物深入研究和應(yīng)用中藥奠定基礎(chǔ)。

Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)主要根據(jù)微生物對(duì)糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行分析,通過(guò)測(cè)定微生物對(duì)目標(biāo)代謝途徑中不同單一碳源利用能力的強(qiáng)弱,可直接反映對(duì)應(yīng)關(guān)鍵酶活力大小,從而比較直觀地表現(xiàn)微生物特定代謝途徑整體代謝能力[10-12]。有效利用Biolog系統(tǒng)對(duì)特定代謝能力進(jìn)行分析,可了解腸道微生物代謝能力及其代謝調(diào)控作用,利用Biolog法來(lái)研究超微七味白術(shù)散對(duì)腸道厭氧微生物代謝多樣性的影響,以探討其對(duì)腸道厭氧微生物的調(diào)控功能,闡明其療效機(jī)理。

1 材料1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠24只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2) g,由上海斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司/中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物

七味白術(shù)散：人參(山西)6 g、木香(云南)6 g、白茯苓(云南)10 g、炒白術(shù)(浙江)10 g、藿香葉(廣東)10 g、葛根(湖南)10 g、甘草(內(nèi)蒙古)3 g。均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

按上述配比,稱取適量的藥物,加冷水浸泡半小時(shí)后煎煮,先用大火煮沸,再改用小火煎煮,煎煮2次,每次煎煮時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),一般15—20 min。將兩次煎煮的藥液混合后即制成七味白術(shù)散傳統(tǒng)湯劑,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

超微藥：將單味中藥超微粉碎,按上述配比稱取適量超微粉末,加入適量開(kāi)水沖泡,攪拌,冷卻后低速離心取上清液,制成超微飲片1/2量湯劑,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器

Biolog微生物自動(dòng)分析儀(型號(hào)E1×808BLG)；厭氧工作站(型號(hào)BAETRON-1)；超凈工作臺(tái)(型號(hào)SW-CJ-1B)；實(shí)驗(yàn)在廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所廣東省環(huán)境科學(xué)與技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.2 試劑

頭孢拉定膠囊(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；批號(hào)101005)硫酸慶大霉素注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司；批號(hào)100928353),用無(wú)菌生理鹽水配成濃度為62.5 g/L的抗生素混合液,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 飼料

由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

24只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后,按照隨機(jī)數(shù)字表將其分為正常組、模型組、傳統(tǒng)七味白術(shù)散湯藥治療組、超微七味白術(shù)散湯藥(1/2)劑量治療組(根據(jù)課題組研究結(jié)果[13-14],選用超微中藥的該劑量與傳統(tǒng)中藥全量進(jìn)行比較),共4個(gè)組,每組6只,雌雄各半,分籠飼養(yǎng)。

2.2 造模方法[15]

正常組給予無(wú)菌水0.4 mL 只-1次-1灌胃,其余各組采用抗生素混合液(頭孢拉定和硫酸慶大霉素按照4∶3的比例混合)0.4 mL 只-1次-1灌胃。每天2次,連續(xù)5 d。

2.3 給藥方法及劑量

造模成功后,灌胃給藥,每天2次,連續(xù)3 d。正常組及模型組給予無(wú)菌水,其余各組按小鼠臨床等效用藥劑量給藥,即傳統(tǒng)七味白術(shù)散傳統(tǒng)湯藥治療組0.16 g kg-1d-1,七味白術(shù)散1/2量超微湯藥治療組0.08 g kg-1d-1。

2.4 小鼠腸道內(nèi)容物的提取

將小鼠頸椎脫臼處死后立即放于超凈工作臺(tái)上,無(wú)菌采集各組空腸到回腸段內(nèi)容物,樣品混合收集于盛滿冰的無(wú)菌袋中,并立即帶回實(shí)驗(yàn)室,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 Biolog-Eco分析

本研究采用31種碳源的生態(tài)板(Biolog-Eco)分析腸道微生物代謝多樣性,碳源的編號(hào)同參考文獻(xiàn)[16]。在無(wú)菌條件下稱取腸道內(nèi)容物5 g,放入已滅菌的盛有45 mL 0.85% NaCl溶液和玻璃珠的三角瓶中,搖床振蕩30 min后,500 r/min離心3 min去除食物殘?jiān)?取上清液5 mL分裝于5支已滅菌的EP管中,10000 r/min離心20 min,棄去上清液,保留沉淀。每支EP管中加入1 mL 0.85%的NaCl無(wú)菌水,渦旋振蕩,收集沉淀于滅菌過(guò)的盛有45 mL 0.85%的NaCl無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中,振蕩10 min,制得腸道內(nèi)容物中微生物的提取液,最終稀釋比例為1∶1000,用于Biolog分析。用8通道加樣器將稀釋1000倍的菌液加入Biolog-Eco培養(yǎng)板上,每孔150 μL。將接種好的培養(yǎng)板放入37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于培養(yǎng)的第4、12、24、48、60、72、96、120天用Biolog讀數(shù)系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)。具體參照Classen等[17-18]的方法。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

(1)小鼠腸道微生物的代謝活性用每孔顏色平均變化率(AWCD)來(lái)描述,計(jì)算公式如下：

AWCD =∑(Ci-R) /31

式中,Ci為各碳源孔在590 nm 下的吸光度值與750 nm下吸光度值的差值；R為Eco 板對(duì)照孔A1的吸光度值,Biolog Eco板的C 源數(shù)目為31[19]。

(2)利用各樣品培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù),計(jì)算其微生物多樣性的Shannon指數(shù)(H′)、 Shannon均勻度(E)、Simpson指數(shù)(1/D)和Mclntosh指數(shù)(U)。計(jì)算方法參照Magurran[20]。

Shannon指數(shù)(H′)

H′=-∑(PilnPi)

式中,Pi= (Ci-R) /∑(Ci-R),表示有碳源的孔與對(duì)照孔A1 的光密度值之差與整板總差的比值。

Shannon均勻度(E)

E = H′/lnS

式中,S表示碳源代謝孔的數(shù)目(Ci-R>0,則表示該孔碳源被利用,該孔即為反應(yīng)孔)。

Simpson指數(shù)(1/D)

式中,ni是第i孔的相對(duì)吸光度值(Ci-R),N是相對(duì)吸光度值的總和(∑(Ci-R)),同時(shí),為防止出現(xiàn)負(fù)值,需將數(shù)據(jù)擴(kuò)大1000倍。

Mclntosh指數(shù)(U)

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003計(jì)算AWCD值并作圖、DPS v7.05進(jìn)行T檢驗(yàn)、SPSS16.0 軟件系統(tǒng)進(jìn)行聚類分析和主成分分析,所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 超微七味白術(shù)散對(duì)小鼠腸道微生物AWCD的影響

平均顏色變化率(AWCD)反映微生物群落代謝的總體活性,其值越大,活性越高；反之,活性越低[21]。由圖1可知,在厭氧培養(yǎng)的4—24 h內(nèi),各組的AWCD值變化不大,且各組之間的差別不明顯。在24 h之后,各組的AWCD值均急劇上升,表明小鼠腸道厭氧和兼性厭氧微生物活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)在不斷增加。培養(yǎng)36 h時(shí),模型組的AWCD值最小,正常組的AWCD值最大,兩個(gè)治療組的AWCD值則比較接近,隨后1/2劑量超微湯藥治療組AWCD值急劇增加,48 h時(shí)其值超過(guò)正常組,位居第一,其次是正常組,而模型組和傳統(tǒng)湯藥治療組則比較接近。72 h后各組AWCD值的大小為：1/2劑量超微湯藥治療組>正常組>傳統(tǒng)湯藥治療組>模型組,直至培養(yǎng)120 h,說(shuō)明1/2劑量超微湯藥治療組小鼠腸道厭氧和兼性厭氧微生物群落代謝的總體活性最高,而模型組的則最低。

圖1 不同組小鼠腸道微生物AWCD隨厭氧培養(yǎng)時(shí)間的變化

3.2 超微七味白術(shù)散對(duì)小鼠腸道微生物多樣性的影響

Shannon指數(shù)表示相同情況下各個(gè)生態(tài)系統(tǒng)微生物群落利用碳源的多與少,Shannon均勻度指數(shù)則包括豐富度和種類中個(gè)體分布的均勻性。Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)是評(píng)估某些最常見(jiàn)種的優(yōu)勢(shì)度和均勻度的指數(shù)。由表1可知,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均為正常組最大,且與其它3組差異極顯著；Shannon均勻度和Mclntosh指數(shù)為1/2劑量超微湯藥治療組最大,且都與模型組差異極顯著；除Shannon指數(shù)外其余各指數(shù)均為模型組最小,且都與正常組和1/2劑量超微湯藥治療組差異顯著或極顯著；Shannon指數(shù)最小為傳統(tǒng)湯藥治療組,且與其余各組差異極顯著?？股亟⑿∈缶菏д{(diào)模型,使腸道微生物的結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生變化,導(dǎo)致模型組小鼠腸道微生物Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均顯著小于正常組。七味白術(shù)散對(duì)腸道微生物有很好的調(diào)控作用,1/2劑量超微湯藥對(duì)腸道微生物的調(diào)控療效明顯好于傳統(tǒng)湯藥,可能與該復(fù)方中有效成分的溶出率有關(guān)[14]。

表1 不同組小鼠腸道微生物的多樣性和均勻度指數(shù)

3.3 不同組小鼠腸道微生物群落代謝變化的聚類分析

圖2 不同組小鼠腸道微生物碳源代謝的聚類分析圖

Biolog Eco板的碳源一般按照化學(xué)性質(zhì)可分：糖類、氨基酸類、聚合物類、羧酸類、胺類和其他化合物,共6大類[16,22]。經(jīng)抗生素造模和七味白術(shù)散治療,小鼠腸道微生物群落發(fā)生了復(fù)雜的變化,使傳統(tǒng)的化學(xué)分類無(wú)法反映微生物群落對(duì)不同碳源的利用情況。由圖2可知,當(dāng)聚類距離≤5時(shí),正常組的碳源被聚為5類,模型組的碳源被聚為4類,傳統(tǒng)湯藥治療組和1/2劑量超微湯藥治療組的碳源被聚為3類,可見(jiàn)造模后治療與否所導(dǎo)致的小鼠腸道微生物群落對(duì)碳源的利用有很大區(qū)別。顯然造模后,模型組小鼠腸道微生物對(duì)碳源的利用情況比較單一,而經(jīng)過(guò)七味白術(shù)散兩種湯藥的治療,對(duì)碳源的利用就相對(duì)比較多樣化,可見(jiàn)七味白術(shù)散的治療效果比較明顯。各組均有D-木糖、D-半乳糖醛酸和N-乙酰-D葡萄糖氨聚為同一類,與正常組相比,模型組還有腐胺、苯乙胺、D-半乳糖γ內(nèi)酯和L-精氨酸未聚在該類,傳統(tǒng)湯藥治療組還有腐胺、苯乙胺、D-半乳糖γ內(nèi)酯、L-精氨酸、L-天門(mén)冬酰胺和D-甘露醇未聚在該類,1/2劑量超微湯藥治療組則有苯乙胺、1-磷酸葡萄糖、D,L-α-磷酸甘油和肝糖未聚在該類。在正常組中,β-甲基-D-葡萄糖苷、甘氨酰-L-谷氨酸與α-丁酮酸、L-蘇氨酸等10種碳源一起被聚為同一類,而在其它3個(gè)組中,該兩種碳源均未聚為該類,且2個(gè)治療組還同有吐溫40未聚為該類。在模型組和1/2劑量超微湯藥治療組D-蘋(píng)果酸和D-纖維二糖聚為同一類,而在正常組和傳統(tǒng)湯藥治療組則未聚為同一類,尤其在正常組,D-蘋(píng)果酸被單獨(dú)聚為一類。在正常組中,α-D-乳糖被單獨(dú)聚為一類,而在其它3組中,α-D-乳糖均與其它多種碳源聚為同一類,尤其在模型組和傳統(tǒng)湯藥治療組中,同有α-D-乳糖、肝糖等共9種碳源聚為同一類,與1/2劑量超微湯藥治療組不同。

當(dāng)聚類距離≤10時(shí),正常組、模型組和1/2劑量超微湯藥治療組的碳源均被聚為2類；傳統(tǒng)湯藥治療組的碳源則被聚為3類,且與聚類距離≤5時(shí)的聚類結(jié)果一樣。模型組和1/2劑量超微湯藥治療組中D-纖維二糖、D-蘋(píng)果酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖γ內(nèi)酯、L-絲氨酸和腐胺共6種碳源被聚為一類。在正常組和傳統(tǒng)湯藥組中,該6種碳源分別被聚為2類。正常組中,D-半乳糖γ內(nèi)酯、D-蘋(píng)果酸和腐胺一類,β-甲基-D-葡萄糖苷、L-絲氨酸和D-纖維二糖為一類；傳統(tǒng)湯藥組中,D-蘋(píng)果酸、L-絲氨酸和腐胺一類,D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷和D-半乳糖γ內(nèi)酯為一類。

3.4 不同組小鼠腸道微生物群落代謝變化的主成分分析

Biolog Eco的數(shù)據(jù)顯示,小鼠腸道微生物對(duì)Eco板上的絕大多數(shù)碳源都具有代謝能力,但是經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),不同組別中某些碳源的吸光度差異明顯,這說(shuō)明,不同小鼠腸道微生物對(duì)碳源的利用能力是不同的。為了進(jìn)一步了解七味白術(shù)散對(duì)小鼠腸道微生物群落代謝能力的影響,對(duì)Biolog所得數(shù)據(jù)實(shí)施主成分分析(PCA)。提取4個(gè)組別中的數(shù)據(jù),通過(guò)分析可知,正常組、模型組、傳統(tǒng)湯藥組和1/2劑量超微湯劑組中,成分1的方差貢獻(xiàn)率分別為：61.68%、57.71%、54.02%和60.46%。

提取31種碳源在2個(gè)主成分上的載荷圖來(lái)分析這31種碳源在4個(gè)組別中的代謝特點(diǎn)。由圖3可知,成分1的方差貢獻(xiàn)率為46.22%,成分2的方差貢獻(xiàn)率為36.83%。正常組中PC1在D-木糖、吐溫80、肝糖、2-羥基苯甲酸和α-丁酮酸等碳源種類上有較高的載荷,表明在正常組中這些碳源對(duì)PC1的貢獻(xiàn)率比較大。模型組中PC1在D-纖維二糖、α-D-乳糖、D-纖維二糖、α-D-乳糖和腐胺等碳源上有較高的載荷。傳統(tǒng)湯藥治療組中PC1在β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、4-羥基苯甲酸、衣康酸和L-蘇氨酸等碳源上有較高的載荷。1/2劑量超微湯藥治療組中PC1在1-磷酸-葡萄糖、α-環(huán)式糊精、D-半乳糖酸γ內(nèi)酯、γ-羥丁酸和L-苯丙氨酸等碳源上有較高的載荷。

圖3 不同組小鼠腸道微生物碳源代謝的主成分分析

正常組中PC2在L-精氨酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖酸γ內(nèi)酯、衣康酸和D-葡糖胺酸)等碳源種類上有較高的載荷,表明在正常組中這些碳源對(duì)PC2的貢獻(xiàn)率比較大。模型組中PC2在L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖酸γ內(nèi)酯和D-半乳糖酸γ內(nèi)酯等碳源種類上有較高的載荷。傳統(tǒng)湯藥治療組中PC2在D-纖維二糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、γ-羥丁酸、L-精氨酸和吐溫40等碳源上有較高的載荷。1/2劑量超微湯藥治療組中PC2在D-甘露醇、衣康酸、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸和吐溫40等碳源上有較高的載荷。

如圖3所示,D-纖維二糖在模型組中對(duì)PC1貢獻(xiàn)率較大,在傳統(tǒng)湯藥治療組和1/2劑量超微湯藥治療組中對(duì)PC2貢獻(xiàn)率較大,而在正常組中對(duì)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率都不大。L-蘇氨酸在正常組、模型組和1/2劑量超微湯藥治療組中對(duì)PC2貢獻(xiàn)率較大,而在傳統(tǒng)湯藥治療組中對(duì)PC1貢獻(xiàn)率較大。衣康酸在正常組和1/2劑量超微湯藥治療組中對(duì)PC2貢獻(xiàn)率較大,在傳統(tǒng)湯藥治療組中對(duì)PC1貢獻(xiàn)率較大,而在模型組中對(duì)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率都不大。肝糖在正常組中對(duì)PC1貢獻(xiàn)率較大,在模型組和傳統(tǒng)湯藥治療組中對(duì)PC2貢獻(xiàn)率較大,而在1/2劑量超微湯藥治療組中對(duì)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率都不大。腐胺在模型組和1/2劑量超微湯藥治療組中對(duì)PC1貢獻(xiàn)率較大,在正常組和傳統(tǒng)湯藥治療組中對(duì)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率都不大。丙酮酸甲酯在正常組合1/2劑量超微湯藥治療組中對(duì)PC1貢獻(xiàn)率較大,而在模型組和傳統(tǒng)湯藥治療組中對(duì)對(duì)PC1和PC2的貢獻(xiàn)率都不大。

4 討論

宿主與腸道微生物之間的代謝關(guān)系復(fù)雜,涉及宿主和腸道微生物生命整個(gè)過(guò)程和各個(gè)方面。腸道微生物及其基因組賦予宿主一些特殊的代謝特性,彌補(bǔ)宿主某些生物學(xué)不足[23]。本研究經(jīng)BIOLOG分析,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸道微生物培養(yǎng)72 h后的AWCD值、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均小于正常組,其聚類分析結(jié)果最簡(jiǎn)單,主成分分析結(jié)果也與正常組區(qū)別明顯,是因?yàn)榭股貙?duì)敏感革蘭陰性桿菌和厭氧革蘭陽(yáng)性菌的抑制作用導(dǎo)致腸道菌群失調(diào),直接影響腸道微生物群落的數(shù)量和結(jié)構(gòu),使得小鼠腸道微生物的某些代謝途徑受到影響,導(dǎo)致其整體代謝活性下降。

微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶等多種酶,對(duì)腸道各種消化作用有重要影響。雙歧桿菌相關(guān)的代謝酶系有果糖-6-磷酸磷酸激酶、半乳糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、D-木糖異構(gòu)酶、結(jié)合膽汁酸水解酶等,在其代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24]。乳酸桿菌通過(guò)發(fā)酵碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類等代謝產(chǎn)生乳酸、揮發(fā)性酸、過(guò)氧化氫、雙乙酰及細(xì)菌素,具有抗菌作用[25-26]。酪酸梭菌能產(chǎn)生B族維生素、維生素K、淀粉酶等物質(zhì)[4]。有研究表明,黃芪多糖和小檗堿的復(fù)合制劑能提高蛋雞腸道淀粉酶和蛋白酶的活性,七味白術(shù)散可使腸道纖維素酶、蛋白酶及淀粉酶活性上升[13],促進(jìn)了腸道對(duì)纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)化合物的利用。七味白術(shù)散復(fù)方中藥化學(xué)成分復(fù)雜,功能多樣,對(duì)微生物的調(diào)控作用復(fù)雜多樣,能促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖[13],黃酮類化合物、甘草酸等對(duì)一些特定的微生物也具有明顯的抑制作用。乳酸菌、雙歧桿菌、酪酸梭菌等腸道有益菌可通過(guò)生物拮抗作用,抑制艱難梭菌等抗生素相關(guān)性腹瀉致病菌、大腸桿菌等條件致病菌的的生長(zhǎng),調(diào)節(jié)菌群失衡,影響腸道菌群的代謝酶系和代謝活性[5],使得傳統(tǒng)湯藥治療組和1/2劑量超微湯藥治療組的整體代謝活性均高于模型組,Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)也都高于模型組,聚類分析和主成分分析結(jié)果也異于正常組和模型組。七味白術(shù)散通過(guò)促進(jìn)腸道有益菌的增殖、抑制有害菌的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)控腸道微生物的平衡,改變腸道菌群的代謝活性。

AWCD值反映微生物群落代謝的總體活性,1/2劑量超微湯藥治療組的AWCD值大于傳統(tǒng)湯藥組,且表示微生物群落的數(shù)量和結(jié)構(gòu)的Shannon指數(shù)、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)均是1/2劑量超微湯藥治療組顯著大于傳統(tǒng)湯藥組(P<0.05或P<0.01),顯然七味白術(shù)散的1/2劑量超微湯藥在對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用方面優(yōu)于傳統(tǒng)湯藥,與譚周進(jìn)等[14]的研究結(jié)果一致,七味白術(shù)散超微粉更有利于其藥效的發(fā)揮。中藥經(jīng)超微粉碎后,粉末粒徑小且分布均勻,增大了其比表面積,而且細(xì)胞壁大部分被破壞, 胞內(nèi)有效成分的溶出阻力減小,從而提高了有效成分的溶出速度及溶出率,有利于藥物的吸收,又超微粉碎可在低溫狀態(tài)下進(jìn)行有利于保留不耐高溫的生物活性成分及各種營(yíng)養(yǎng)成分,從而提高藥效[27]。

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Effects of ultra-micro powder qiweibaizhusan on metabolism diversity of intestinal anaero-microbiotia in diarrheal mice with dysbacteriosis

WANG Chunhui1,4, ZHANG Hualing2, ZHANG Qiling3, YIN Kangkang4, HU Ruxiao1, TAN Zhoujin4,*

1HunanDomesticFungusResearchInstitute,Changsha410013,China2HunanEngineeringResearchCenterofPreciousandEndangeredMedicinalMaterials,Changsha410007,China3HunanInstituteofNuclearAgriculturalSciencesandSpace-inducedBreeding,Changsha410125,China4HunanUniversityofTCM,Changsha410208,China

Compound traditional Chinese medicine is one of the medication characteristics of traditional Chinese medicine, as well as its essence. Intestinal microbiotia have a crucial effect on hosts′ metabolic function and life activities. Intestinal microbiotia are devoted to dissolution and transformation of the Chinese herbal medicinal ingredients by hydrolysis and restoring reaction. In order to investigate the microecological mechanisms for ultra-micro Qiweibaizhusan on diarrheal mice with intestinal dysbacteriosis, the mouse model with dysbacteriosis was constructed by intragastric administration with antibiotics mixture composed of cefradine capsules and gentamycin sulfate injection. One group of diarrheal mice were treated with the traditional decoction of Qiweibaizhusan, the other group of diarrheal mice were given 1/2 dose of ultra-micro powder Qiweibaishusan, and the normal group and the diarrheal group mice were treated with sterilized water by intragastric administration. After three days′ treatment, the intestinal microbiotia were extracted, and their carbon metabolisms were determined by Biolog Microbial Identification System. The results showed that all groups of average of wall color development (AWCD) tended to be stable throughout 72 h cultivation period, but AWCD of the 1/2 dose of ultra-micro powder group > the normal group > the traditional decoction group > the model group. The microbial diversity index, including Shannon index and Simpson index, in the normal group were the largest, and there were significant differences compared with that in other groups (P<0.01). The Shannon evenness and Mclntosh index of the 1/2 dose of ultra-micro powder treated group were very significantly different compared to that of other group (P<0.01,P<0.05), except that the Shannon evenness wasn′t significantly different compared with that of the normal group (P>0.05). The results of clustering analysis and principal components analysis suggest that bacteriostasis function of antibiotics was prominent, and some metabolic pathways of intestinal microbiotia in mice were influenced. The metabolic diversity of intestinal microbiotia in mice was gradually regained by the regulatory functions of 1/2 dose of ultra-micro powder and traditional decoction of Qiweibaishusan. There were differences in the regulatory roles of the traditional decoction and ultra-micro powder decoction. The regulatory role of 1/2 dose of ultra-micro powder was more notable than that of traditional decoction. The ultra-micro Qiweibaizhusan had a prominent regulatory role on metabolic diversity of intestinal anaerobic microbiotia in mice, and had a good treatment effect on diarrhea with intestinal dysbacteriosis.

ultra-micro powder traditional Chinese medicine; qiweibaizhusan; Biolog-Eco; metabolic diversity; intestinal anaerobic microbiotia

國(guó)家自然科學(xué)基金(81173214)

2013-09-18;

2014-04-16

10.5846/stxb201309182306

*通訊作者Corresponding author.E-mail: tanzhjin@sohu.com

王春暉,張華玲,張祺玲,尹抗抗,胡汝曉,譚周進(jìn).超微七味白術(shù)散對(duì)腸道厭氧微生物代謝多樣性的調(diào)控作用.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(14):4843-4851.

Wang C H, Zhang H L, Zhang Q L, Yin K K, Hu R X, Tan Z J.Effects of ultra-micro powder qiweibaizhusan on metabolism diversity of intestinal anaero-microbiotia in diarrheal mice with dysbacteriosis.Acta Ecologica Sinica,2015,35(14):4843-4851.