槐米提取物的制備工藝及其紫外吸收特性考察

史方超 喬立業(yè) 陸 崟 蘇 華 任海祥南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京 210002

槐米為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的花蕾，已有2000 多年藥用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》還將其列為上品。 槐米中含有蘆丁、槲皮素、三萜皂苷、多糖黏液質(zhì)等成分，蘆丁為主要成分[1]。 蘆丁是天然的黃酮類化合物，維生素P 的主要組分之一[2]。近年來有不少國內(nèi)外醫(yī)藥工作者對(duì)蘆丁的藥理作用進(jìn)行過研究， 槐米中蘆丁的含量高達(dá)12%～20%[3]。 研究表明，蘆丁有抗癌防癌、鎮(zhèn)痛、降血壓、預(yù)防中風(fēng)、抗菌抗病毒、抗衰老、抗炎抗過敏、抗自由基及抗氧化等多種作用[4-5]。 蘆丁能增強(qiáng)毛細(xì)管的韌性，增強(qiáng)血管壁的彈性，對(duì)高血壓患者具有防止腦血管破裂功效，具有較強(qiáng)的藥理作用[6]。 本研究采用超聲波提取法提取槐米，以多指標(biāo)考察提取成分，并以槐米中蘆丁含量為考察指標(biāo)進(jìn)一步研究，最后確定了槐米主要防曬成分蘆丁的提取工藝，為槐米蘆丁在工業(yè)化生產(chǎn)及化妝品防曬霜中的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀，KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），UV-2100型紫外-分光光度計(jì)（島津儀器上海有限公司），AE240電子分析天平（METTLER TOLEDO 精密儀器有限公司），F(xiàn)A1204S 分析天平（上海市精密儀器有限公司），密封式搖擺型粉碎機(jī)CF-6A（江蘇金壇市醫(yī)療藥材器械廠）。

1.2 試藥

槐米（批號(hào)：121010，南京海源藥事服務(wù)有限公司中藥飲片廠）， 經(jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院王曙東主任藥師鑒定為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 槐米的提取

將槐米粉碎后， 取0.5 g 槐米細(xì)粉置50 mL 容量瓶中，加入15 mL 70%乙醇，在65℃下超聲提取30 min。超聲后過濾并定容至50 mL 容量瓶中，重復(fù)提取兩次，合并提取液，精密吸取提取液1 mL，定容到25 mL 容量瓶中制成供試品液。

2.2 槐米提取液的紫外吸收

取槐米供試品液1 mL，加70%乙醇定容至25 mL容量瓶中，以70%乙醇為空白，在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定各波長(zhǎng)下的吸光度值。 分別計(jì)算UVC（200～280 nm）、UVB（280～320 nm）、UVA（320～400 nm）各區(qū)間平均吸光度值。

2.3 蘆丁的含量測(cè)定[7]

2.3.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 精取一定量的對(duì)照品于50 mL 量瓶中，用甲醇定容，進(jìn)行紫外掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為257 nm。 見圖1。

圖1 對(duì)照品蘆丁的紫外吸收?qǐng)D

2.3.2 色譜條件的選擇[8-9]色譜柱：Lichrospher 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰醋酸（45∶55），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm，柱溫30℃。樣品溶液過0.45 μm 微孔濾膜，進(jìn)樣10 μL。 見圖2。

圖2 蘆丁HPLC 圖

2.3.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取于110℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20.48 mg，加甲醇定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（含蘆丁0.4096 mg/mL）。

2.3.4 供試品溶液的制備 樣品溶液的制備：精密稱取本品（藥材）0.03 g，置50 mL 容量瓶中，加70%乙醇適量，65℃下超聲提取30 min 使溶解，取出放冷至室溫，70%乙醇定容至刻度，搖勻，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL， 置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。 經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜濾過后，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀中，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=18 630X+9.9292（r＝1，n＝5）。 結(jié)果表明蘆丁進(jìn)樣量在0.02048～0.32768 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下液相色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5 次，蘆丁峰面積的RSD 為0.15%（n＝5）。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱定本品5 份， 按照“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液制備得到5 份供試品溶液，分別精密吸取10 μL 注入液相色譜儀中，記錄蘆丁峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算各供試品中蘆丁的含量，結(jié)果平均含量為207.98 mg/g，RSD 為0.8%（n＝5）。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 照“2.3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用“2.3.2”項(xiàng)下液相色譜條件，分別在0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣10 μL，記錄蘆丁峰面積，測(cè)定供試品標(biāo)示含量，RSD 為0.23%， 表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合實(shí)驗(yàn)需要。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取槐米細(xì)粉 （60 目）0.015 g，共9 份，分別置9 個(gè)50 mL 量瓶中，分別精密加入“2.3.3”項(xiàng)下的蘆丁對(duì)照品溶液作為儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液4、5、6 mL 各3 份， 制成低、 中、 高濃度三組，按“2.3.4”項(xiàng)下的方法制備即得。分別精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，計(jì)算各供試品含量，結(jié)果平均加樣回收率為98.15%，RSD 為2.25%（n=9）。

2.4 單因素考察

2.4.1 紫外吸收的單因素考察 以乙醇為提取溶劑，分別從乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、提取次數(shù)方面對(duì)槐米提取液的吸光度值的變化進(jìn)行考察。見圖3。

圖3 紫外吸收的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3A 可見，在不同乙醇濃度下，槐米提取液在各紫外區(qū)間的平均吸光度值先升高后降低，在乙醇60%濃度下為最高， 紫外輻射UVR （UVR=UVA+UVB+UVC）=1.741（n=3）；圖3B 顯示，在不同的料液比條件下，槐米提取液的紫外平均吸光度值先升高后降低，在料液比1∶30 條件下，紫外平均吸光度值相對(duì)最高，UVR=1.576（n=3）；圖3C 表明，在不同的超聲溫度條件下，槐米提取液的紫外平均吸光度值先升高后略有降低， 在50℃時(shí)紫外平均吸光度值最高，UVR=1.973（n=3）；圖3D 表明，各超聲時(shí)間下除10 min 外其他條件下紫外平均吸光度值基本差不多；圖3E 表明，提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)中， 槐米提取液在各區(qū)間的紫外平均吸光度值基本一樣， 提取5次時(shí)紫外平均吸光度值最高，UVR=1.658（n=3）。

2.4.2 蘆丁含量的單因素考察 分別從乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、提取次數(shù)方面對(duì)槐米提取液中蘆丁含量的變化進(jìn)行考察。 見圖4。

由圖4A 可見， 蘆丁的提取率先升高后降低，以60%乙醇濃度時(shí)為最高， 蘆丁含量為188.1 mg/g （n=3），因此選擇60%乙醇濃度。隨著溶劑量的增加，在料液比1∶10～1∶30 之間蘆丁的含量逐漸升高。 圖4B 顯示，當(dāng)溶劑量超過30 倍量時(shí)，蘆丁含量隨著溶劑量的增加反而降低。 故選擇料液比1∶30，此時(shí)蘆丁含量最高，為189.0 mg/g（n=3）。 圖4C 表明，蘆丁在30～50℃的含量隨溫度的升高而增加， 而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，易引起蘆丁結(jié)構(gòu)的破壞和生物活性喪失，其含量反而略有下降。因此，選擇超聲溫度50℃，蘆丁含量為184.6 mg/g（n=3）。 由圖4D 可見，在超聲時(shí)間30 min左右蘆丁的提取率最高。 超過30 min 后蘆丁含量反而下降，超聲時(shí)間過長(zhǎng)可能使蘆丁受到破壞。因此，選擇超聲時(shí)間為30 min，蘆丁含量為191.1 mg/g（n=3）。由圖4E 可見，提取2 次時(shí)蘆丁的提取率最高，蘆丁含量為177.1 mg/g（n=3）。

提取時(shí)溫度越高，分子熱運(yùn)動(dòng)越激烈，使溶劑與提取物分子間的傳遞加速， 有利于目標(biāo)產(chǎn)物的溶出，有效成分的提取率就越高， 而超聲時(shí)間決定生產(chǎn)周期，因此，它是工藝研究中一個(gè)十分重要的考察因素。由圖4E 所示，在提取次數(shù)單因素試驗(yàn)中表明，多次提取會(huì)造成蘆丁氧化從而使得蘆丁含量下降，而且使得實(shí)驗(yàn)步驟過于繁瑣，因此選擇提取2 次為最佳。

2.5 正交試驗(yàn)考察

根據(jù)“2.4”項(xiàng)下的結(jié)果，超聲波提取法中主要影響因素為乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）4 個(gè)因素。以四因素三水平建立因素水平表，并依此設(shè)計(jì)L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表1、2。

由表3 槐米紫外吸收方差分析所示，從方差比的大小可知，D＞A＞B＞C，影響槐米紫外吸收的主次因素順序?yàn)槌暅囟龋疽掖紳舛龋玖弦罕龋境晻r(shí)間， 超聲溫度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），最佳提取條件為A3B2C2D3。由表4 蘆丁的正交試驗(yàn)方差分析表明，從方差比的大小可知，D＞A＞B＞C，影響槐米中蘆丁含量的主次因素順序?yàn)槌暅囟龋疽掖紳舛龋玖弦罕龋境晻r(shí)間，而其中超聲溫度、乙醇濃度和料液比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），最佳提取條件為A3B2C2D3。 綜合上述結(jié)果，最佳提取條件為A3B2C2D3。

表1 提取蘆丁影響因素與水平

圖4 蘆丁含量的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 蘆丁的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)考察

取槐米0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，加入70%乙醇15 mL，在65℃下超聲提取30 min，重復(fù)提取2 次。 在最佳工藝條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，分別測(cè)定槐米提取液的紫外吸收度、蘆丁含量，取平均值，由表5 結(jié)果可知，槐米藥材中蘆丁的UVR 達(dá)到1.834，蘆丁含量為198.63 mg/g ，該提取工藝穩(wěn)定，提取率高。

表3 槐米紫外吸收方差分析

表4 蘆丁提取方差分析

表5 優(yōu)選提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 槐米提取方法

中藥槐米的提取方法一般有醇提法、 熱水提取法、堿提酸沉法、超聲波提取法等[10-11]。 超聲波法具有提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、能避免高溫對(duì)提取成分的影響等優(yōu)點(diǎn)，最終采用超聲波提取法制備槐米提取液。

3.2 槐米蘆丁的防曬作用

槐米蘆丁能增強(qiáng)和恢復(fù)血管壁的彈性，降低毛細(xì)血管的通透性，增強(qiáng)毛細(xì)血管的韌性，對(duì)皮膚有著較強(qiáng)的抗自由基氧化和抗輻射作用，對(duì)紫外線具有很強(qiáng)的吸收作用， 有明顯的清除細(xì)胞活性氧自由基的作用，是目前較為理想的一種天然廣譜防曬劑[12]。

3.3 太陽光中各波段紫外線作用

太陽光中的UVA 為長(zhǎng)波紫外線，有強(qiáng)穿透力，能使皮膚干燥，加速表皮細(xì)胞中黑色素形成，使得膚色變黑[13]，這也是誘發(fā)皮膚癌的重要原因之一。UVB 為中波紫外線，中等穿透力，但對(duì)皮膚作用力最強(qiáng)，能使皮膚表皮細(xì)胞中的核酸或蛋白質(zhì)變性， 長(zhǎng)期或過量照射會(huì)使皮膚曬黑，并引起紅腫和脫皮。 UVC 短波紫外線對(duì)皮膚的傷害最大，短時(shí)間內(nèi)照射就能灼傷皮膚，長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度的照射還會(huì)誘發(fā)皮膚癌[14-15]。所以本研究在對(duì)槐米提取物的紫外各區(qū)間進(jìn)行紫外吸收度的考察。

3.4 單因素考察試驗(yàn)

單因素考察試驗(yàn)表明，槐米提取液的紫外吸收值大小與蘆丁含量高低成正比，這也說明槐米提取液的紫外吸收與其蘆丁的含量有著密切的關(guān)系。 因此，筆者對(duì)它們同時(shí)進(jìn)行了正交試驗(yàn)考察[16]。 紫外吸收方差分析結(jié)果表明，溫度有顯著差異。 蘆丁提取方差分析結(jié)果顯示，乙醇濃度、料液比和溫度均有顯著差異，兩者最佳提取條件一致，這也表明了蘆丁含量是考察槐米提取液紫外吸收能力的重要指標(biāo)。最終選擇優(yōu)化條件為：稱取適量槐米細(xì)粉，加入30 倍量的70%乙醇，超聲溫度65℃，超聲30 min，重復(fù)提取2 次。 提取的蘆丁含量可達(dá)198.63 mg/g。

本研究對(duì)槐米防曬成分蘆丁的紫外吸收及其提取工藝進(jìn)行了詳細(xì)研究，對(duì)開發(fā)有關(guān)槐米防曬產(chǎn)品提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，將會(huì)在今后研制防曬中藥復(fù)方劑型的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

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