全反式維甲酸對腹膜透析相關性腹膜纖維化大鼠轉化生長因子β1、結締組織生長因子、α 平滑肌肌動蛋白表達的影響

李敏芝 熊燕移 史偉文 張莞靈 卓華欽

廣東省東莞市第三人民醫(yī)院腎內科，廣東東莞 523320

腹膜透析（peritoneal dialysis）是一種以人體腹膜為透析膜的透析方案， 操作時需將透析液灌注至腹腔， 并通過腹膜另一側的毛細血管網交換溶質和水分，最終清除患者體內潴留的代謝產物，同時補充機體所缺乏的相關物質[1]。腹膜透析技術具有操作簡便、血流動力學影響小、 殘余腎臟功能保護好等優(yōu)勢，但也存在腹膜纖維化等相關并發(fā)癥。腹膜纖維化是腹膜透析主要并發(fā)癥之一，也是多數腹膜透析患者退出腹膜透析的主要原因[2]。 全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA） 是動物體內維生素A 代謝的中間產物，具有廣泛的生理學及藥理學效用，為分析該藥物在腹膜透析中的抗腹膜纖維化中的作用，本研究選取雄性SD 大鼠進行研究，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇40 只雄性SD 大鼠，周齡6～8 周，體重220～260 g，由山東大學動物實驗研究中心提供，動物合格證號：SCKX20140017； 所有大鼠均喂養(yǎng)于室溫24℃、安靜、光照12 h、濕度45%、自由進食進水的環(huán)境中，編號后隨機分為對照組、模型組、實驗1 組、實驗2組，每組各10 只。

1.2 藥品與試劑

選用慶華邦制藥有限公司生產的ATRA；選用美國Baxter 醫(yī)療用品有限公司生產的4.25%腹膜透析液； 選用武漢博士德生物工程有限公司生產的兔抗大鼠轉化生長因子-β1（TGF-β1）、結締組織生長因子（CTGF）以及α 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體；選用美國Sigma 公司生產的二甲亞砜；選用福州邁新生物技術開發(fā)有限公司生產的濃縮型DAB 顯色劑；選用立陶宛MBI 公司生產的逆轉錄試劑盒；選用京博大泰克生物基因技術有限公司生產的PCR反應緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 對照組：腹腔注射生理鹽水10 mL/d+5 mL 磷酸鹽緩沖液稀釋的二甲亞砜；模型組：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+5 mL 磷酸鹽緩沖液稀釋的二甲亞砜；實驗1 組：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+ATRA 2 mg/kg；實驗2 組：腹腔注射4.25%腹透液10 mL/d+ATRA 5 mg/kg。 所有大鼠均藥物干預4 周，期間自由進食、飲水。

1.3.2 檢測指標 干預4 周后處死大鼠，處死前1 h 對大鼠進行腹膜平衡實驗。 局部麻醉后，向所有大鼠腹腔注入腹透液20 mL，30 min 后打開腹腔，吸取液體，稱重，計算超濾量。同時給予大鼠股動脈取血操作，血標本置于-5℃溫箱內待用。

避開注射部位取大鼠腹膜及腸系膜組織，一部分標本4%多聚甲醛固定， 一部分置于含1.5 mL Trizol的EP 管內。 選用荷蘭威圖Seleetra 全自動生化儀檢測血液樣本中的尿素、葡萄糖濃度及肝細胞生長因子（HGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）、白細胞介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子（VEGF）表達水平。將多聚甲醛固定的樣本常規(guī)石蠟包埋， 切片， 脫蠟，H2O2滅活，滴入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液，微波加熱至沸騰，冷卻，洗滌，BSA 封閉，滴入兔抗大鼠臟層腹膜組織中TGF-β1、CTGF 或α-SMA 多克隆抗體一抗，洗滌，山羊抗兔IgG 二抗，洗滌，BAD 顯示，封片，鏡檢，并采用Imageproplus 6.0 軟件進行數據提取與處理。1.3.3 觀察指標 觀察對比四組大鼠的體重變化情況、腹膜功能變化情況[超濾量（UF）、透析液尿素濃度（D）、血漿尿素濃度（Purea）、初始腹透液葡萄糖濃度（D0）、透出液葡萄糖濃度（D1）、計算D/Purea、D1/D0]、TGF-β1、CTGF、α-SMA 的表達變化情況、 各組大鼠血清細胞因子HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 的變化情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 對數據進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組實驗大鼠的一般情況變化

各組大鼠均正常進食、進水，無實驗大鼠死亡，實驗1 組和實驗2 組大鼠有不同程度的脫毛、 豎毛現象；四組實驗大鼠的體重在實驗第1 天比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；實驗第4 周，模型組大鼠體重最高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 四組大鼠的體重變化情況（g，±s）

表1 四組大鼠的體重變化情況（g，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與實驗1 組比較，▲P ＜0.05

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2.2 四組實驗大鼠的腹膜功能測定情況

實驗第4 周，模型組和實驗1 組的腹膜功能指標UF、D/Purea、D1/D0測定值較對照組均有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；實驗2 組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。 見表2。

表2 四組實驗大鼠的腹膜功能測定情況（±s）

表2 四組實驗大鼠的腹膜功能測定情況（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與實驗1 組比較，▲P ＜0.05； UF：超濾量； D：透析液尿素濃度； Purea：血漿尿素濃度； D0：初始腹透液葡萄糖濃度；D1：透出液葡萄糖濃度

組別 只數 UF（mL） D/Purea D1/D0對照組模型組實驗1 組實驗2 組F 值P 值10 10 10 10 10.4±0.5 4.9±0.8*7.2±1.1*#9.8±1.3#▲18.436 0.001 0.49±0.05 0.76±0.11*0.62±0.08*#0.51±0.04#▲7.066 0.032 0.74±0.09 0.39±0.07*0.63±0.06*#0.71±0.08#▲9.707 0.016

2.3 四組實驗大鼠腹膜組織的纖維化細胞因子表達情況

與對照組比較，模型組、實驗1 組、實驗2 組的臟層腹膜組織中TGF-β1、CTGF、α-SMA 免疫組化檢測結果均發(fā)生顯著的變化，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；且實驗1 組、 實驗2 組較模型組的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表3。

表3 四組實驗大鼠腹膜組織的纖維化細胞因子表達情況（±s）

表3 四組實驗大鼠腹膜組織的纖維化細胞因子表達情況（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與實驗1 組比較，▲P ＜0.05；TGF-β1：轉化生長因子-β1；CTGF：結締組織生長因子；α-SMA：α 平滑肌肌動蛋白

組別 只數 TGF-β1 CTGF α-SMA對照組模型組實驗1 組實驗2 組F 值P 值10 10 10 10 126.7±18.4 634.9±47.2*388.5±31.9*#226.5±27.3*#▲31.723 0.001 67.8±13.9 498.5±71.3*308.5±59.1*#187.4±46.4*#▲18.749 0.001 83.9±28.5 673.5±182.7*408.2±151.4*#276.3±98.9*#▲10.083 0.005

2.4 四組實驗大鼠的血清纖維化細胞因子變化情況

模型組、實驗1 組、實驗2 組HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平均較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；實驗1 組、實驗2 組的HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平顯著低于模型組， 差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表4。

表4 四組實驗大鼠的血清纖維化細胞因子變化情況（ng/L，±s）

表4 四組實驗大鼠的血清纖維化細胞因子變化情況（ng/L，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05HGF：葡萄糖濃度及肝細胞生長因子；BMP-7：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7；IL-6：白細胞介素-6；VEGF：血管內皮生長因子

組別 只數 HGF BMP-7 IL-6 VEGF對照組模型組實驗1 組實驗2 組F 值P 值10 10 10 10 108.4±19.6 276.4±25.1*194.5±17.2*#148.5±16.6*#16.682 0.001 112.8±14.9 348.5±31.7*225.7±23.5*#183.9±27.4*#12.831 0.001 32.6±9.4 108.5±17.3*67.9±13.5*#47.8±14.7*#12.191 0.001 0.18±0.01 0.53±0.09*0.32±0.07*#0.26±0.06*#12.223 0.001

3 討論

腹膜纖維化多見于腹膜透析中晚期，其病理學表現為腹膜間皮質細胞脫落、微絨毛喪失、細胞外基質沉積、細胞間隙增大、膠原纖維排列紊亂等[3]。 間皮細胞損傷是腹膜纖維化早期病變基礎，隨著透析時間的延長，透析液內的葡萄糖將進一步抑制間皮細胞的增殖，并同時干擾細胞外基質的代謝，導致腹膜間皮細胞形態(tài)改變，最終纖維化。 纖維化的腹膜將無法繼續(xù)進行腹膜透析，這將影響患者的進一步治療[4]。 因此，如何有效地降低腹膜纖維化成為腹膜透析治療工作中的重點。

ATRA 是維甲酸的重要活性形式，可與維甲酸受體相互作用，進而調節(jié)、影響胚胎發(fā)育，對多種細胞（如腫瘤細胞、平滑肌細胞等）生殖、分化具有重要作用。 此外，ATRA 還具有抗炎及調節(jié)細胞外基質合成的功效。 近些年的研究顯示，ATRA 在動物模型中具有極高的抗纖維化及細胞增殖能力，并開始應用于治療成纖維細胞大量增殖相關皮膚疾病的防治中[5]。研究顯示，ATRA 可通過調節(jié)腎臟組織的TGF-β1表達水平來影響細胞外基質代謝，降低血小板衍生因子水平，增強系膜細胞外基質金屬蛋白酶的表達，最終延緩腎小球的硬化[6]。 為分析ATRA 對腹膜透析相關腹膜纖維化的影響， 本研究進行大鼠造模實驗發(fā)現，模型組和實驗1 組的腹膜功能指標UF、D/Purea、D1/D0測定值較對照組均有不同程度的下降， 提示腹膜透析對大鼠腹膜功能具有明顯損傷，造模成功。 本研究發(fā)現，相比照組，模型組、實驗1 組、實驗2 組的臟層腹膜組織中TGF-β1、CTGF、α-SMA 免疫組化檢測結果均發(fā)生顯著的變化（P ＜0.05），實驗1 組、實驗2組較模型組表達水平更低（P ＜0.05）。 臟層腹膜組織中TGF-β1 是臨床公認的強效致纖維化因子，參與著多種器官的纖維化過程。 TGF-β1主要由巨噬細胞、T淋巴細胞合成，具有多種生理功能，對細胞外基質的形成、血管的生成、炎癥以及組織修復等均有重要作用[7]。 動物實驗表明，大量注入TGF-β1腺病毒載體后，大鼠將出現明顯腹膜增厚、血管新生以及間質細胞增殖情況， 其腹膜功能顯著下降， 提示高表達的TGF-β1對腹膜纖維化具有重要作用[8]。CTGF 屬于CCN家族的一員，具有促細胞增殖、調節(jié)細胞外基質、促細胞黏附及趨化的能力。 CTGF 可介導TGF-β1促纖維化，是腹膜及其他臟器纖維化的重要影響因子[9]。 α-SMA 是真核細胞的骨架蛋白，參與著微絲的構成，是細胞轉化為成肌成纖維細胞的標志性蛋白。

本研究中還發(fā)現，模型組、實驗1 組、實驗2 組HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平均較對照組顯著升高（P ＜0.05），實驗1 組、實驗2 組的HGF、BMP-7、IL-6、VEGF 表達水平顯著低于模型組（P ＜0.05）。HGF 是急性肝損傷動物血漿內的一種蛋白因子，對肝再生具有重要作用[10-11]。 體外實驗表明，HGF 可降低、逆轉腎間質纖維化、肝纖維化等臟器纖維化進程[12-13]。 BMP-7 是人體間充質細胞分化為骨、軟骨、肌腱、韌帶的重要誘導蛋白。 IL-6 是炎癥因子的一種，可由間皮細胞或浸潤的炎癥細胞合成， 炎癥是纖維化的重要病理誘因之一[14-16]。 VEGF 具有促腹膜血管生成能力， 對腹膜纖維化病理生理過程具有重要促進作用。

綜上所述，TGF-β1、CTGF、α-SMA 等細胞因子是腹膜透析相關腹膜纖維化的重要影響因子，而ATRA可通過調節(jié)大鼠TGF-β1、CTGF、α-SMA 等細胞因子的表達來抑制腹膜纖維化過程，并維持大鼠腹膜功能。

[1] 賈真，姬麗華，陳景荷，等.轉錄因子Twist 促進腹膜透析患者腹膜纖維化的作用機制研究[J].解放軍醫(yī)學雜志，2013，38（11）：879-884.

[2] 李英楠，張鸝，呂海濤，等.阿托伐他汀對腹膜透析大鼠腹膜纖維化的影響及機制探討[J].山東醫(yī)藥，2014，1（24）：25-27.

[3] 王紅，趙占正，申萬琴，等.腹膜透析大鼠腹膜組織中HIF-1α 和CTGF 的表達[J].鄭州大學學報：醫(yī)學版，2012， 47（2）：205-208.

[4] Karin G，Gerritsen，Hilde P，et al. Renal proximal tubular dysfunction is a major determinant of urinary connective tissue growth factor excretion [J]. Renal Physiology：American Journal of Physiology，2010，298（6）：1457-1464.

[5] 孫立霞，馬健飛，鄧文艷.高糖對大鼠腹膜間皮細胞整合素連接激酶、結締組織生長因子及α-平滑肌肌動蛋白表達的影響[J].中國血液凈化，2013，12（6）：323-326.

[6] Cassie M，Fujita N，Huang BL，et al.Hypoxia-inducible factor （HIF）-1α and CCN2 form a regulatory circuit in hypoxic nucleus pulposus cells： CCN2 suppresses HIF-1α level and transcriptional activity [J]. The Journal of Biological Chemistry，2013，288（18）：12654-12666.

[7] 夏武，楊宇平，陳永鳳，等.維甲酸對轉化生長因子β1 誘導的HFL-I 細胞Ⅲ型膠原、STAT3 和PIAS3 表達的影響[J].中國病理生理雜志，2012，28（6）：1114-1119.

[8] Lin BR，Chang CC，Chen RJ. Connective tissue growth factor acts as a therapeutic agent and predictor for peritoneal carcinomatosis of colorectal cancer[J].Clinical Cancer Research：Official Journal of the American Association for Cancer Research，2011，17（10）：3077-3088.

[9] 黃玉晗.腹膜透析與腹膜纖維化[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2014，23（4）：382-384.

[10] 韋永光，林沁，潘淼，等.羅格列酮抑制大鼠腹膜透析相關性腹膜纖維化中TGF-β1 和CTGF 的表達[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2014，1（7）：583-586.

[11] 趙焱，鄧揚，閆弘睿，等.肝細胞生長因子與2 型糖尿病心臟自主神經病變相關性研究[J].中國實驗診斷學，2015，19（3）：409-411.

[12] 張敏，趙菁莉.中醫(yī)藥防治腹膜纖維化的研究進展[J].現代生物醫(yī)學進展，2014，14（1）：166-168，197.

[13] 王新榮，楊智慧，江平，等.堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子在胃腸癌中的表達及意義[J].中國醫(yī)學前沿雜志：電子版，2015，7（1）：98-100.

[14] 王桂花，趙金文，陳連華，等.全反式維甲酸對腹膜透析大鼠臟層腹膜組織中CTGF 和α-SMA 表達的影響[J].山東醫(yī)藥，2014，54（4）：28-30.

[15] 梁秀軍，翟澤玲，董文娟，等.膠原性關節(jié)炎大鼠炎性細胞因子的動態(tài)觀察[J].中國實驗動物學報，2013，21（3）：57-60，后插9.

[16] 高共鳴，農魯明，周棟，等.白細胞介素-6 通過p38 蛋白調控髓核細胞的增殖和遷移[J].中華實驗外科雜志，2015，32（1）：117-119.