利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)對(duì)涂陰肺結(jié)核診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)

譚英征 陳雙華 龍?jiān)畦T 李 丹 傅京力 周杜鵑 傅金球

1.湖南省株洲市中心醫(yī)院感染內(nèi)科，湖南株洲 412007； 2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南株洲 412012

近年來，結(jié)核患者日益增多，目前肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)診斷主要應(yīng)依靠痰涂片找抗酸桿菌、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）及痰培養(yǎng)。 因痰涂片對(duì)痰液標(biāo)本內(nèi)結(jié)核桿菌含量要求高，達(dá)到一定濃度方能檢測(cè)陽性，涂陰肺結(jié)核患者往往因?yàn)樘低科顾崛旧幮裕R床上不易早期發(fā)現(xiàn)，常被延誤治療。TST 是個(gè)操作簡單、方便、快捷的篩查結(jié)核的免疫學(xué)方法，在臨床上應(yīng)用廣泛，但有較高的假陽性和假陰性率，對(duì)結(jié)核感染與卡介苗接種后感染無法鑒別，降低了它的臨床價(jià)值[1]。痰液結(jié)核桿菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)核桿菌生長緩慢，培養(yǎng)周期長，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別要求高，故傳統(tǒng)的臨床診斷涂陰肺結(jié)核試驗(yàn)方法有限。因此，尋找一種能快速、敏感診斷涂陰肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)技術(shù)十分重要。

利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增（Xpert MTB/RIF） 檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核桿菌具有較高的敏感性和特異度[2]。本研究通過對(duì)131 例涂陰肺結(jié)核和123 例其他肺病患者進(jìn)行Xpert MTB/RIF 檢測(cè)， 探討Xpert MTB/RIF 在涂陰肺結(jié)核快速、早期診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014 年6～12 月到株洲市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）結(jié)核門診就診患者為研究對(duì)象。 入選涂陰肺結(jié)核患者131 例 （涂陰肺結(jié)核患組）， 年齡18～82歲，平均（41.2±15.3）歲；肺結(jié)核確診患者114 例（肺結(jié)核確診組），年齡21～79 歲，平均（39.6±16.5）歲；其他肺病患者123 例（其他肺病組），年齡17～78 歲，平均（40.4±17.5）歲。 該研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與研究者均簽署了知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 入選標(biāo)準(zhǔn) 肺結(jié)核確診患者除有發(fā)熱、 咳嗽、咳痰、盜汗等臨床表現(xiàn)及影像學(xué)資料支持外必須有痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果。 涂陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：①具有午后低熱、咳嗽、咯血、盜汗、乏力等典型肺結(jié)核臨床癥狀及肺部CT 表現(xiàn)者； ②痰涂片抗酸染色陰性者；③支氣管或肺部組織病檢支持結(jié)核性改變者；④診斷性抗結(jié)核治療2 個(gè)月后癥狀改善，復(fù)查CT 提示有好轉(zhuǎn)者[3]。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①影像學(xué)不典型者行支氣管鏡檢查或病理檢查明確為非結(jié)核感染者；②仍不能明確者行診斷性抗結(jié)核治療2 個(gè)月后癥狀及影像學(xué)病變無改善者。 ③常規(guī)行痰涂片、痰固體培養(yǎng)，排除結(jié)核感染者。

1.2.3 其他肺病者 包括肺病腫瘤（25 例）、普通肺炎（53 例）、支氣管擴(kuò)張（15 例）、慢性阻塞性肺疾?。?6例）肺部其他疾?。? 例）。

1.3 研究方法

對(duì)所有入選患者均進(jìn)行TST、痰固體培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF 檢測(cè)。TST 所用試劑購自北京高科技生命科技開發(fā)有限公司，痰固體培養(yǎng)基為羅氏培養(yǎng)基，由珠海貝索公司生產(chǎn)，Xpert MTB/RIF 儀器及試劑由美國Cepheid 公司研發(fā)生產(chǎn)，均在有效期內(nèi)使用。 特異度=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性人數(shù)/（真陽性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%； 陰性預(yù)測(cè)值=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%。

1.3.1 TST 試驗(yàn) 吸取試劑5 U（0.1 mL）注入前臂內(nèi)側(cè)上中1/3 交界處皮內(nèi)，形成皮丘。 經(jīng)72 h 觀察注射部位反應(yīng)，考慮到現(xiàn)代人卡介苗接種率高，本研究以硬結(jié)的橫徑及縱徑平均≥10 mm 為陽性。

1.3.2 痰固體培養(yǎng) 痰培養(yǎng)采用4%氫氧化鈉處理分離培養(yǎng)。吸取痰標(biāo)本到前處理管中，加入4%氫氧化鈉前處理液充分混勻， 靜置15 min 后取吸管吸取前處理液均勻接種在培養(yǎng)基斜面上，觀察培養(yǎng)情況，記錄生長結(jié)果[4-5]。

1.3.3 Xpert MTB/RIF 檢測(cè) 取1 mL 痰液標(biāo)本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液按1∶2 比例混合，在渦旋震蕩器上震蕩15～30 s， 室溫靜置15 min。 取混合液2 mL 轉(zhuǎn)移至一次性多室塑料反應(yīng)盒中， 然后將反應(yīng)盒放置到檢測(cè)模塊中， 儀器進(jìn)行自動(dòng)化分析， 約2 h后可讀取結(jié)果[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF 在肺結(jié)核確診組與其他肺病組的檢測(cè)情況比較

通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF 檢測(cè)在肺結(jié)核確診組中為82.45%（94/114），在其他肺病組中為0.81%（1/123）， 肺結(jié)核確診組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率明顯高于其他肺病組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核確診組的陽性預(yù)測(cè)值為98.95%（94/95），陰性預(yù)測(cè)值85.92%（122/142）。

2.2 Xpert MTB/RIF、TST 在涂陰肺結(jié)核組與其他肺病組的檢測(cè)情況比較

涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率為80.92%（106/131），其他肺病組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率為0.81%（1/123）。涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率明顯高于其他肺病組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 涂陰肺結(jié)核組中TST 檢測(cè)陽性率為64.89%（85/131）， 與涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率80.92%比較， 明顯低于涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率， 差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。Xpert MTB/RIF 檢測(cè)對(duì)涂陰肺結(jié)核的陽性預(yù)測(cè)值為99.07%（106/107）， 陰性預(yù)測(cè)值83.00%（122/147）。 見表1。

表1 兩組Xpert MTB/RIF、TST 檢測(cè)結(jié)果（例）

2.3 Xpert MTB/RIF、痰培養(yǎng)在涂陰肺結(jié)核與其他肺病組的檢測(cè)情況比較

涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率為80.92%（106/131），痰培養(yǎng)檢測(cè)陽性率為71.76%（94/131）。涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率明顯高于痰培養(yǎng)檢測(cè)陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)特異度為99.19%（122/123），與涂陰肺結(jié)核組中痰培養(yǎng)檢測(cè)特異度100.00%（123/123）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 見表2。

表2 兩組Xpert MTB/RIF、痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果（例）

3 討論

肺結(jié)核是世界上致死率最高的傳染性疾病之一，隨著社會(huì)老齡化，肺結(jié)核患者逐年增加[7-9]。 目前我國肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查方法是痰涂片找抗酸桿菌，其耗時(shí)短、花費(fèi)小，但檢查敏感度低、對(duì)標(biāo)本含菌量高，致使很多涂陰肺結(jié)核患者漏診[10]。 痰培養(yǎng)結(jié)核桿菌是結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[11]，但痰培養(yǎng)方法存在周期長、敏感度相對(duì)低，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求高，耗時(shí)長，不易普及[12]，造成涂陰肺結(jié)核臨床診斷困難、治療延誤。早診斷、 早治療涂陰肺結(jié)核患者對(duì)控制結(jié)核病的傳播、減少結(jié)核耐藥，具有十分重要的社會(huì)意義。因此臨床上亟需開發(fā)出一種快速、準(zhǔn)確、安全的診斷方法。

Xpert MTB/RIF 檢測(cè)法是利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)， 采用Cepheid 公司GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)，針對(duì)rpoB 基因81bp 利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變[13]，它是將樣品的準(zhǔn)備、 定量PCR 擴(kuò)增和熒光檢測(cè)集于一體的核酸擴(kuò)增檢測(cè)分析系統(tǒng)。 操作簡單，無需太多培訓(xùn)，只需要在標(biāo)本盒中加入待檢測(cè)標(biāo)本，系統(tǒng)可自動(dòng)完成標(biāo)本純化、離心、DNA 提取、DNA 特異序列檢測(cè)，2 h 內(nèi)便可得到檢測(cè)結(jié)果[14]，封閉性好，不易造成交叉污染，對(duì)涂陰肺結(jié)核患者的敏感度高[15]。 多中心研究證實(shí)Xpert MTB/RIF 檢測(cè)敏感度與特異度高、 耗時(shí)短，被世界衛(wèi)生組織為遏制結(jié)核病推薦的檢驗(yàn)方法[16]。本研究中對(duì)131 例涂陰肺結(jié)核組患者痰液予Xpert MTB/RIF 檢測(cè)，陽性率為80.92%（106/131），肺結(jié)核確診組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率為82.45%（94/114），兩者陽性率均高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。其他肺病組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率為0.81%（1/123）。涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率明顯高于其他肺病組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。提示Xpert MTB/RIF 檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核患者有較高的敏感性。

TST 是結(jié)核感染診斷的一個(gè)重要參考指標(biāo)[17]，將結(jié)核桿菌產(chǎn)物注入體表，如受試者感染了結(jié)核分枝桿菌，則形成超敏反應(yīng)性炎癥，出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)[18]。 臨床使用非常廣泛，但其特異性受到接種卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌的影響，且有較多的假陰性，臨床意義有限[19]。 本研究中對(duì)涂陰肺結(jié)核組患者中行TST 檢測(cè)，陽性率為64.89%（85/131），與涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽性率（80.92%）比較，明顯低于涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核確診組的陽性預(yù)測(cè)值為98.95%，陰性預(yù)測(cè)值為85.92%；對(duì)涂陰肺結(jié)核的陽性預(yù)測(cè)值為99.07%，陰性預(yù)測(cè)值為83.00%。說明對(duì)懷疑涂陰肺結(jié)核患者行Xpert MTB/RIF 檢測(cè)對(duì)診斷有較大幫助。痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，本研究中， 涂陰肺結(jié)核組中痰培養(yǎng)檢測(cè)陽性率為71.76%（94/131）， 與Xpert MTB/RIF 檢 測(cè) 陽 性 率[80.92%（106/131）]比較，痰培養(yǎng)檢測(cè)陽性率明顯低于Xpert MTB/RIF 檢測(cè)陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。涂陰肺結(jié)核組中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)特異度高達(dá)99.19%（122/123），與涂陰肺結(jié)核組中痰培養(yǎng)檢測(cè)特異度[100.00%（123/123）]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 但痰培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別要求高，不能常規(guī)開展，且耗時(shí)長，培養(yǎng)周期為6～8 周，不利于患者的早期合理治療[20]。 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)自動(dòng)化程度高， 唯一手動(dòng)操作就是將標(biāo)本置入一次性標(biāo)本盒內(nèi)，檢測(cè)報(bào)告時(shí)間2 h，比痰培養(yǎng)節(jié)省甚多時(shí)間[21]。

Xpert MTB/RIF 檢測(cè)是一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[22]，綜合國內(nèi)外的診治報(bào)道[23-27]進(jìn)展，臨床應(yīng)用高于TST、痰培養(yǎng)，可更好地輔助臨床醫(yī)師對(duì)涂陰肺結(jié)核患者進(jìn)行早期診斷和治療， 為結(jié)核病的控制、預(yù)防提供了有力的幫助，值得臨床推廣。

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