磷脂酰肌醇蛋白聚糖3與ki67在不同分化程度肝細胞癌中的表達分析

董 坤 常 靜 祖可佳 王欣欣 劉 暉 馮驥良 呂福東

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院病理科，北京 100069

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在男性癌癥中排名第5 位（523 000 例/年，所有癌癥中占7.9%），在女性癌癥中排名第7 位（226 000 例/年，所有癌癥中占6.5%）[1]。 臨床初篩HCC 首選肝臟超聲及血清甲胎蛋白（AFP）檢測，有肝硬化的患者血清AFP＞200 ng/mL時強烈提示HCC 可能， 但并不是所有HCC 患者的AFP 水平都會升高，而且AFP 升高并不單純出現(xiàn)在HCC中[2]。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，無論血清中還是組織中AFP的敏感性及特異性均不高[3]。 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是近年來比較熱門的一種用于肝細胞癌診斷的標志物，因其敏感性好，特異性高，被認為可能是一種新型癌胚因子[4]。 GPC3 在胚胎肝臟中表達豐富，但是在成人正常肝臟中無表達[5]。 有研究發(fā)現(xiàn)GPC3 在HCC 中表達的敏感性為68%～72%，特異性為92%[1]。但是GPC3 在不同分化程度的HCC 中敏感性差異的研究較少。 ki67 作為腫瘤細胞增殖活性的標志物，常用于即時反映腫瘤增殖細胞的數(shù)量，判斷腫瘤的惡性程度及預后[6]。 本研究的目的是通過對不同分化程度的肝細胞癌組織中GPC3 和ki67 表達的情況進行分析，研究GPC3 在不同分化程度的HCC 中表達的強度，同時研究不同分化程度的HCC 中GPC3 和ki67 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集2010 年7 月～2014 年7 月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院病理科的HCC 部分肝切除標本共90 例，其中高分化30 例，中分化30 例，低分化30 例。

1.2 材料和試劑

GPC3， ki67 抗體及二抗PV6000 均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有標本先經(jīng)過10%的甲醛固定后，取材，按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm 連續(xù)切片，之后進行HE 染色，肝癌病理診斷經(jīng)2 名副主任以上醫(yī)師復診。 HCC 的鏡下分級采用WHO 推薦HCC 分級標準[7]。1.3.1 染色方法 采用EnVision 兩步法，上述切片經(jīng)烤片、脫蠟，梯度乙醇由高至低入水，入3%過氧化氫5 min，PBS 緩沖液浸透3 次，每次5 min，放入pH 6.0 檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復：高壓鍋噴氣后，加熱2 min，變中火2 min，關(guān)火后燜10 min，放入冷水中冷卻至37℃，之后入PBS 緩沖液洗3 次，加GPC3 一抗（鼠抗人單克隆抗體），4℃冰箱過夜，PBS 緩沖液浸3 次，每次5 min，加二抗PV6000（通用型抗體）37℃10 min，PBS 緩沖液浸3 次，DAB 顯色，PBS 液終止染色，甲醛逐級由低至高濃度脫水至入二甲苯，封片。 ki67 染色步驟同GPC3。

1.3.2 判斷方法 ki67 染色位于細胞核，免疫組化診斷標準[8]：細胞膜或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性；每張切片隨機選取5 個高倍視野（400×），每個視野數(shù)100 個細胞， 按陽性細胞所占百分比評分：診斷分級為≤5%，＞5%～30%，＞30%～50%，＞50%。GPC3 染色位于胞漿及細胞膜。 免疫組化診斷標準[8]：細胞膜或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性；每張切片隨機選取5 個高倍視野（400×），每個視野數(shù)100 個細胞， 按陽性細胞所占百分比評分：“-”：＜5%的腫瘤細胞著色；“1”：5%～25%的腫瘤細胞著色；“2”：＞25%～50%的腫瘤細胞著色；“3”：＞50%～75%的腫瘤細胞著色；“4”：＞75%的腫瘤細胞著色；其次染色強度評分：不著色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。最后將染色強度與陽性細胞所占百分比計分乘積作為每例染色的綜合評分，0 分為（-），1～2 分為（+），3～5 分為（++），6～9 分為（+++），≥10 分為（++++）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0 對數(shù)據(jù)進行分析， 正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 90 例患者一般資料情況

90 例患者，年齡38～84 歲，平均（53.7±0.1）歲；男68 例，女22 例；HBsAg 陽性66 例，陰性24 例；腫瘤直徑≤5 cm 者46 例，＞5 cm 者44 例；腫瘤單發(fā)者74 例，多發(fā)者16 例；伴腫瘤壞死者30 例，無腫瘤壞死者60 例；伴脈管內(nèi)癌栓者18 例，無脈管內(nèi)癌栓者72 例；有肝硬化背景者56 例，無肝硬化背景者34 例。 GPC3的表達強度與患者的年齡、性別、HBsAg 陽性與否、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤壞死、脈管內(nèi)癌栓及肝硬化無關(guān)（P ＞0.05）。 見表1。

2.2 不同分化程度的HCC HE 組織染色

高分化HCC 顯示細胞輕度異型，肝板結(jié)構(gòu)紊亂，可見腫瘤細胞假腺樣排列（圖1A，封三）；中分化HCC顯示腫瘤細胞中度異型，核漿比增加，腫瘤細胞呈假腺樣或細梁狀排列（圖1B，封三）；低分化HCC 顯示腫瘤細胞異型性明顯，細胞核大，核膜不規(guī)則，可見核仁，腫瘤細胞呈團巢狀或?qū)嵭云瑺钆帕校▓D1C，封三）。

圖1 不同分化程度的HCC 組織HE 染色（見內(nèi)文第24頁）

2.3 GPC3 在高、中、低分化HCC 組織中的表達

GPC3 在HCC 中的著色在細胞膜和細胞質(zhì)，大部分肝細胞癌是混合著色，HCC 分化越低，GPC3 著色越強（圖2，封三）。 不同分化的HCC 組織中GPC3 表達的強度及陽性率性況具體見表2。 高分化的HCC中GPC3 陽性率為50.00%，其中“+～++”陽性率為43.33%，“+++～++++”陽性率為6.67%；中分化的HCC中陽性率均為83.33%，其中“+～++”陽性率為60.00%，“+++～+++++”陽性率為23.33%；低分化的HCC 中陽性率為90.00%，其中“+～++”陽性率為23.30%，“+++～++++”陽性率為66.67%。 統(tǒng)計結(jié)果顯示：GPC3在低分化的HCC 中的陽性率明顯高于中分化及高分化，并且中分化高于高分化，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。 低分化組中GPC3 的強陽性（+++～++++）率明顯高于中分化及高分化，并且中分化明顯高于高分化，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。 說明GPC3的表達與HCC 的分化程度有關(guān)。

圖2 GPC3 免疫組化（SP 法）結(jié)果（見內(nèi)文第24頁）

表1 GPC3 表達強度與一般資料的關(guān)系（例）

表2 不同分化組中GPC3 表達的強度及陽性率情況（例）

2.4 Ki67 在高、中、低分化肝細胞癌中的表達

ki67 為細胞核著色，在HCC 組織中的陽性率為90%（81/90），在周圍肝組織內(nèi)未見表達（圖3，封三）。不同化為的HCC 組織中ki67 的表達情況具體見表3，統(tǒng)計學結(jié)果顯示： 低分化組中ki67 的表達明顯高于中分化及高分化組， 并且中分化組高于高分化組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），說明ki67 的表達與HCC 的分化程度有關(guān)。

圖3 ki67 免疫組化（SP 法）結(jié)果（見內(nèi)文第25 頁）

表3 不同分化HCC 中ki67 的表達情況（例）

2.5 不同分化組中GPC3 的表達與ki67 增殖指數(shù)之間的關(guān)系

Spearman 相關(guān)分析顯示：GPC3 的表達與ki67 表達呈正相關(guān)（r = 0.551，P = 0.000），即HCC 中GPC3表達越強，ki67 表達越強。

3 討論

GPC3 編碼的蛋白屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通過糖基磷脂肽肌錨蛋白錨定在細胞表面。 GPC3 在細胞的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，該基因突變可導致細胞增殖和凋亡失衡，且在多種腫瘤和細胞株中常常發(fā)生甲基化[9]。 在HCC 組織中GPC3 表達增多，并且在HCC 形成過程中分泌入血[10]。 有的研究提示在肝細胞癌的特異性表達率為52.5%～85%， 而在肝臟良性病變包括：肝硬化（cirrhosis）、肝細胞腺瘤（hepatocellular adenoma，HCA）及局灶結(jié)節(jié)狀增生（focal nodular hyperplasia，F(xiàn)NH）中的表達率為0[5]；而且GPC3 的特異性及敏感性均高于AFP，血清中GPC3 mRNA 的表達明顯高于AFP（71.7% 比51.3%），尤其是當腫瘤直徑小于3 cm 時GPC3 的表達更是高于AFP 的表達（77%比43%）[4，11-12]。 由此分析GPC3 可以作為一個特異性免疫標志物來鑒別肝細胞癌和肝外腫瘤及肝臟良性病變。 研究結(jié)果顯示GPC3 的著色強度與腫瘤的分化程度有關(guān)，GPC3 在HCC 中的陽性率為74.4%，分化越低表達強度越強，分化越高表達強度越低，總體陽性率也隨分化程度的降低而升高。 盡管現(xiàn)在關(guān)于GPC3 的表達與HCC 生存率的研究較少[9]，但是諸多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的分化程度與預后相關(guān)，分化越差預后越差，GPC3 在HCC中的表達與分化程度呈負相關(guān)[13-14]，即分化越差表達越強。 以上的研究提示GPC3 的表達與HCC 的預后相關(guān)，GPC3 的表達強度對HCC 的預后可能有提示作用。 有學者對5 組關(guān)于HCC 的實驗進行Meta 分析，發(fā)現(xiàn)GPC3 的高表達與患者的總體生存率（OS）及無病生存率（DFS）相關(guān)，HCC 組織中高表達GPC3 預示手術(shù)后DFS 較差[9]。 又有研究發(fā)現(xiàn)低水平表達GPC3 可以增加手術(shù)后腫瘤復發(fā)的風險[15]。

ki67 基因定位于第10 號染色體，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物定位于細胞核， 由相對分子量為345 000 和395 000 兩條肽鏈組成，其在G1后期開始出現(xiàn)，在S 期和G2期逐漸升高，M 期達高峰， 有絲分裂結(jié)束后降解消失，G0期無表達[16-17]。因此，ki67 表達的高低對評價細胞增殖活性，研究腫瘤的生物學行為和預后有重要意義。 本研究中，HCC 組織中ki67 陽性表達率為90%，在周圍肝組織內(nèi)未見表達，說明HCC 的增殖活性明顯大于非腫瘤的肝細胞；HCC 分化越差，ki67 增殖指數(shù)越高，這與HCC 的浸潤性生長、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等生物學行為密切相關(guān)。

目前，GPC3 的表達與腫瘤細胞增殖指數(shù)之間的關(guān)系目前研究尚少。 有研究發(fā)現(xiàn)GPC3 可以促進腫瘤細胞的增殖，作為致癌基因GPC3 可以使c-Myc 原癌基因活化，從而激活多條細胞信號轉(zhuǎn)導通路而促進細胞的增殖，目前研究較多的是Wnt 及IGF 途徑[9]。 本研究在不同分化程度的HCC 中GPC3 與ki67 提示的細胞增殖指數(shù)呈正相關(guān)，即GPC3 表達強度越高，ki67增值指數(shù)越高，說明GPC3 對腫瘤的生物學行為有一定的提示作用， 即GPC3 表達越強，HCC 的增殖活性越高，腫瘤轉(zhuǎn)移、復發(fā)的概率越高，患者的預后越差。

HCC 對化療藥物不敏感，除了手術(shù)切除，目前尚無有效的系統(tǒng)的治療手段。GPC3 特異性的表達于HCC中，或許它可以成為HCC 靶向治療的分子靶點[18-19]，目前Ⅰ期臨床試驗正在進行[20]。 本研究對不同分化程度的HCC 表達GPC3 的敏感性的研究， 可能會為將來分子靶向治療提供篩選條件。

綜上所述， 聯(lián)合檢測HCC 組織中GPC3 和ki67增殖指數(shù)的表達有著重要的臨床意義，不但有利于揭示HCC 發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移的機制，更重要的是能夠?qū)颊哳A后的評價提供重要幫助。對GPC3 在不同分化程度HCC 中敏感性的研究也為HCC 的靶向治療提供參考依據(jù)，從而幫助提高療效，延長患者的生存期。

[1] Wang CH，Wey KC，Mo LR，et al. Current trends and recent advances in diagnosis，therapy，and prevention of hepatocellular carcinoma [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（9）：3595-3604.

[2] 趙春華，周文峰，陳維華，等.甲胎蛋白在原發(fā)性肝癌首診中的價值[J].臨床肝膽病雜志，2013，29（9）：698-701.

[3] Bruix J，Sherman M. American association for the study of liver diseases.management of hepatocellular carcinoma：an update [J]. Hepatology，2011，53（3）：1020-1022.

[4] Filmus J，Capurro M. Glypican-3：a marker and a therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J].FEBS J，2013，280（10）：2471-2476.

[5] Gong L，Wei LX，Ren P，et al. Dysplastic nodules with glypican-3 positive immunostaining：a risk for early hepatocellular carcinoma [J]. PLoS One，9（1）： e87120.

[6] Raghunandhakumar S，Paramasivam A，Senthilraja S，et al.Thymoquinone inhibits cell proliferation through regulation of G1/S phase cel cycle transition in N-nitrosodiethylamine-induced ex-perimental rat hepatocelular carcinoma [J]. Toxicol Let，2013，223（1）：60-72.

[7] Christopher DM，Julia A，Pancras CW，et al. WHO classification of tumors of soft tissue and bone [M]. 4th Edition.Paris：IARC，2013：155-156.

[8] Timek DT，Shi J，Liu H，et al. Arginase-1，HepPar-1，and glypican-3 are the most effective panel of markers in distinguishing hepatocellular carcinoma from metastatic tumor on fine-needle aspiration specimens [J]. Am J Clin Pathol，2012，138（2）：203-210.

[9] Li J，Gao JZ，Du JL，et al. Prognostic and clinicopathological significance of glypican-3 overexpression in hepatocellular carcinoma： a meta-analysis [J]. World J Gastroenterol，2014，28（20）：6336-6344.

[10] Ozkan H，Erdal H，Kocak E，et al. Diagnostic and prognostic role of serum glypican 3 in patients with hepatocellular carcinoma[J].J Clin Lab Anal，2011，25：350-353.

[11] Xu C，Yan Z，Zhou L，et al. A comparison of glypican-3 with alpha-fetoprotein as a serum marker for hepatocellular carcinoma： a meta-analysis [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2013，139（8）：1417-1424.

[12] Tangkijvanich P，Chanmee T，Komtong S，et al. Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepatocellular car- cinoma from non-malignant chronic liver disease and other liver cancers [J]. J Gastroenterol Hepatol，2010，25（1）：129-137.

[13] Reddy OL，Cates JM，Gellert LL，et al. Loss of FOXA1 drives sexually dimorphic changes in urothelial differentiation and is an independent predictor of poor prognosis in bladder cancer [J]. Am J Pathol，2015，185（5）：1385-1395.

[14] 邰伯軍，姚敏，顧星，等.磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 對肝癌細胞增殖和凋亡的影響[J].臨床肝膽病雜志，2013，29（11）：863-866.

[15] Jin GZ，Dong H，Yu WL，et al. A novel panel of biomarkers in distinction of small well-differentiated HCC from dysplastic nodules and outcome values [J]. BMC Cancer，2013，13：161.

[16] Haroon S，Hashmi AA，Khurshid A，et al. Ki67 index in breast cancer： correlation with other prognostic markers and potential in pakistani patients [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（7）：4353-4358.

[17] 葉文靜，邢衛(wèi)斌，秦蘭英，等.Survivin 和Ki-67 在皮膚鱗癌和基底細胞上皮瘤的表達及相關(guān)性分析[J].中國皮膚性病學雜志，2010，24（1）：20-22.

[18] Yu D，Dong Z，Yao M，et al. Targeted glypican-3 gene transcription inhibited the proliferation of human hepatoma cells by specific short hairpin RNA [J]. Tumor Biol，2031，34（2）：661-668.

[19] 陳潔，姚敏，姚登福，等.磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 介導的信號通路與肝癌靶向治療[J].臨床肝膽病雜志，2013，29（1）：77-80，后插1.

[20] Sawada Y，Yoshikawa T，Nobuoka D，et al. Phase I trial of a Glypican-3-derived peptide vaccine for advanced Hepatocellular carcinoma： immunologic evidence and potential for improving overall survival [J]. Clin Cancer Res，2012，18（13）：3686-3696.