Lenti-Toll樣受體4-siRNA的構(gòu)建及對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383的影響

張小藝 孟紅艷 彭 敏 司 皓 馬宏博

1.山東大學附屬省立醫(yī)院中醫(yī)科，山東濟南 250021；2.山東大學公共衛(wèi)生學院，山東濟南 250012

內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）是導致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的重要因素，Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）是LPS 信號向細胞內(nèi)傳導的“門戶蛋白”[1]， 其信號通路的過度激活是導致炎性反應爆發(fā)失控的重要機制。 TLR4 可以選擇性識別LPS，LPS 與單核巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞細胞膜上的TLR4 結(jié)合，引起炎癥瀑布效應[2]。 調(diào)節(jié)TLR4 信號通路有可能成為膿毒癥的一種治療策略[3]。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）近年來取得相當大的進展，研究人員利用RNAi 作為研究工具引入到細胞或整個生物RNAi 試劑，用以識別新的細胞通路和潛在的藥物靶點[4]。 慢病毒載體是一種高效率的轉(zhuǎn)基因和基因治療工具，其最大優(yōu)勢在于能夠感染分裂和靜止狀態(tài)下的細胞，并且能夠高效、穩(wěn)定地整合于宿主細胞內(nèi)[5]。 本實驗通過構(gòu)建TLR4 siRNA 慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至大鼠巨噬細胞NR8383，并通過實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測TLR4 siRNA 干擾的效果，為進一步探討TLR4 信號通路在ALI 發(fā)生、發(fā)展中的機制提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚合酶鏈反應（PCR）反應試劑，Primer（R＆F）合成、dsDNA oligo、293T 細胞株、大腸埃希菌菌株DH5α、病毒載體均由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司提供；Taq 酶、SYBR Master Mixture 購于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer 來 自 于NEB；QIAGEN Plasmid 大抽Kit 來自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol 購 自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit購于Amersham 公司；positive clone 測序由上海美季生物技術(shù)有限公司完成；胎牛血清、DMEM 購自Gibco公司；Opti-MEM 購自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 TLR4 基因RNAi 慢病毒載體構(gòu)建

1.2.1.1 siRNA 靶點設計 針對TLR4 目的基因靶基因序列，采用Invitrogen 軟件（https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）設計4 個RNA 干擾靶點序列。見表1。

表1 TLR4 siRNA 靶點設計

1.2.1.2 RNAi 慢病毒載體構(gòu)建 工具載體選擇GV115，框架結(jié)構(gòu)為hU6-MCS-CMV-EGFP，酶切位點：Age Ⅰ，EcoR Ⅰ。 合成含干擾序列的DNA oligo，經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的載體連接。 見表2。

表2 RNAi 合成片段

1.2.1.3 克隆制備與鑒定 通過T4 DNA ligase 將酶切回收的載體和DNA 片段進行鏈接反應， 將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的DH5α 細菌感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB 溶液，使用GV115 通用引物，進行菌落PCR 鑒定實驗。 將PCR 陽性克隆進行測序，經(jīng)結(jié)果比對，確認測序引物與鑒定引物中的上游引物相同即為構(gòu)建成功的TLR4 目的基因RNAi 慢病毒載體。測序結(jié)果通過Chromas 軟件進行分析。PCR 鑒定陽性克隆的引物為：上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′，下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。 PCR 鑒定的分組為1：陰性對照（ddH2O）；2：陰性對照（空載）；3：Marker 自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；4：TLR4-RNAi 轉(zhuǎn)化子（a：Tgt-1；b：Tgt-2；c：Tgt-3；d：Tgt-4）。

1.2.2 RNAi 慢病毒小量包裝

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提， 在Lipofectamine 2000 介導下共轉(zhuǎn)染293T 細胞，培養(yǎng)8 h 后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基， 加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集293T 細胞上清液，過濾離心后取病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，－80℃保存，取1 支以熒光法進行病毒生物學滴度測定。

1.2.3 慢病毒感染細胞

1.2.3.1 細胞培養(yǎng) 實驗細胞大鼠肺巨噬細胞株NR8383購自ATCC 公司，培養(yǎng)于含15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mmo/L）、NaHCO3（1.5 g/L）的Ham′s F12 培養(yǎng)基中，細胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，在對數(shù)生長期進行實驗。

1.2.3.2 NR8383 細胞慢病毒感染 將處于對數(shù)生長期的大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 進行胰酶消化，制成細胞懸液，接種于6-well 培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細胞融合度達到約30%， 按設計組別分別加入慢病毒顆粒進行NR8383 細胞的感染實驗，12 h 后觀察細胞狀態(tài)，如無明顯細胞毒性，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)基。 感染3 d 后熒光顯微鏡下觀察GFP 表達，熒光率達80%以上，收集細胞，感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。 見表3。

表3 細胞感染實驗分組和病毒用量

1.2.4 qPCR 內(nèi)源篩靶

收集生長狀態(tài)良好的目的細胞， 提取RNA，總RNA 抽提根據(jù)Trizol 操作說明書進行。 RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照M-MLV 操作說明書進行，采用RTPCR 檢測目的基因的表達情況。TLR4 上游引物序列：5′-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3′，下游引物序列：5′-ATGCCAGAGCGGCTACTCA-3′， 擴增長度：247 bp；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴增長度：114 bp。 用TP800 序列檢測系統(tǒng)軟件（TaKaRa 公司）制作擴增曲線并進行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)2-ΔΔCt數(shù)據(jù)分析法，比較各組TLR4 基因mRNA 表達水平。

1.2.5 有效靶點慢病毒大量包裝及驗證內(nèi)源性目的基因表達敲減

根據(jù)RT-PCR 結(jié)果，篩選出敲減效率最高的1 個RNAi 有效靶點，進行慢病毒大量包裝。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 陽性克隆的PCR 鑒定

載體上的引物進行PCR 鑒定陽性克隆， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和完整性，每個序列陽性克隆各取3 個樣品菌種送上海美季公司測序， 結(jié)果通過Chromas 軟件進行分析。 鑒定電泳結(jié)果顯示，TLR4 vshRNA 片段已經(jīng)成功插入質(zhì)粒，挑選的陽性克隆菌液測序結(jié)果與實驗要求的DNA 序列完全一致。 見圖1。

2.2 慢病毒滴度測定

圖1 陽性克隆的PCR 鑒定

測定前1 d 為293T 細胞鋪板， 每孔加4×104個細胞，在Eppendorf 管中加入90 μL 無血清培養(yǎng)基，將10 μL 病毒原液加入到第1 個管中， 混勻后取10 μL加入到第2 個管中， 如此分別稀釋為1/10～1/100 萬，感染293T 細胞，24 h 后加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后，觀察綠色熒光蛋白表達，通過GFP 陽性細胞計數(shù)法測定LV-TLR4-RNAi（Tgt-1、2、3、4）的滴度分別為5×108、4×108、4×108、5×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染細胞

感染后16 h 更換培養(yǎng)基，感染后96 h 熒光拍照。圖2 顯示各組慢病毒成功感染NR8383 細胞。

圖2 熒光顯微鏡下慢病毒感染NR8383 細胞GFP的表達（100×）

2.4 RT-PCR 內(nèi)源篩靶

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，NR8383 細胞中，相對于陰性對照組，KD2 組TLR4 基因敲減效率達到65%（P ＜0.05）（圖3，封三），認為是KD2 有效靶點。

圖3 RT-PCR 檢測TLR4 mRNA 的表達

2.5 病毒大量包裝后的靶點再次驗證

根據(jù)RT-PCR 篩選結(jié)果，選取敲減效率最高的KD2 號靶點進行病毒的大量包裝后， 經(jīng)定量PCR 測定，在NR8383 細胞中，相對于NC、KD2 組TLR4 基因敲減效率達到90.1%（P ＜0.05）。

3 討論

ALI 發(fā)病的關(guān)鍵是一種肺內(nèi)過度性、失控性的炎性反應， 多種炎癥細胞和炎癥介質(zhì)相互的激活與釋放，導致瀑布式的炎性反應，形成肺的過度損傷[6-7]。研究表明，ALI 患者TLR4 的表達水平與急性肺部炎癥程度及氣道上皮細胞的損傷、肺部中性粒細胞增加相關(guān)[8]。TLR4 可以早期識別侵入體內(nèi)的細菌啟動炎性反應，核因子（NF）-κB、激活蛋白-1（AP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等的激活均為其下游事件， 最終導致多種炎性因子的瀑布式釋放，放大炎癥效應[9]。 研究證實，TLR4 基因缺陷小鼠對內(nèi)毒素的敏感性明顯下降，肺組織病理損傷和肺水腫程度減輕[10]，以TLR4 基因為靶點，從上游調(diào)控這種瀑布式的炎癥效應，可為治療急性感染性疾病提供一種新的策略[11]。

RNAi 技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因沉默技術(shù)，RNAi 能夠非常特異地降解與之序列相應單個內(nèi)源基因mRNA， 相對少量的dsRNA 就可以使表型達到缺失突變體程度，抑制基因表達效率很高[12-14]，已成為研究信號傳導通路的良好工具。 RNAi 技術(shù)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)增強免疫反應、控制炎癥和治療自身免疫性疾病中都發(fā)揮了作用[15]。

RNAi 的沉默效應與基因的轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)[16]。基因轉(zhuǎn)染的方法可分為病毒轉(zhuǎn)染和非病毒轉(zhuǎn)染，常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體[17]。 慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，可感染分裂細胞及非分裂細胞， 轉(zhuǎn)移基因片段容量較大，目的基因表達時間較長，還可整合到宿主細胞的染色體基因組上，不易引發(fā)宿主免疫反應[18-20]，已成為基因功能研究及基因治療領域中熱門的基因轉(zhuǎn)移載體[21]。

本研究成功構(gòu)建了4 個TLR4 基因RNAi 慢病毒表達載體， 具有較高滴度，4 種慢病毒載體感染大鼠肺巨噬細胞NR8383 后，TLR4 基因mRNA 表達量均明顯下降，其中LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）抑制作用最明顯，使mRNA 表達下降65%，將2 號靶點進行病毒的大量包裝后，TLR4 基因敲減效率達到90.1%，表明本研究構(gòu)建的慢病毒RNAi 表達載體在NR8383 細胞內(nèi)能有效地沉默TLR4 基因表達， 為后續(xù)研究TLR4信號通路在ALI 發(fā)病過程中的作用及中藥干預的靶點奠定了基礎。

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