吡格列酮對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈微栓塞后心肌損傷的影響

楊華鋒 李 浪 王現(xiàn)濤 劉 濤 劉陽(yáng)春 陸元喜

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西南寧 530021

冠狀動(dòng)脈微栓塞（CME）指急性冠脈綜合征（ACS）患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊自發(fā)性破裂后，斑塊碎片和脂質(zhì)成分等致血栓成分流向遠(yuǎn)端微小血管引起微循環(huán)堵塞，也是行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈治療（PCI）的常見(jiàn)并發(fā)癥[1]。CME 導(dǎo)致心肌損傷，易發(fā)生“慢血流”或“無(wú)復(fù)流”。 研究表明， 炎性因子參與的心肌組織局部炎性反應(yīng)與CME 發(fā)生后心肌損傷密切相關(guān)[2]。 已證實(shí)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）激動(dòng)劑的代表藥物吡格列酮可抑制體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)，起保護(hù)心肌細(xì)胞效應(yīng)[3]。 吡格列酮還能抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷[4-5]，因此，本研究觀察吡咯列酮預(yù)處理對(duì)大鼠CME 后心肌組織炎性因子的影響，探討PPARγ激動(dòng)劑預(yù)防CME 致心肌損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

42 μm 微栓塞球凍干粉（2×107個(gè)/g）購(gòu)自挪威Dynal 公司；鹽酸吡格列酮片（杭州中美華東制藥有限公司，15 mg×7 片/盒，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050500，批號(hào)：140702）；兔抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）多克隆抗體、HRP 羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自北京博奧森生物公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及分組

體質(zhì)量200～250 g 的成年雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 （動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK 桂2014-0002）。 參照既往文獻(xiàn)方法[6]，10%水合氯醛2.5～3.0 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠， 頸正中切口暴露氣管，經(jīng)口盲插入氣管導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)及心功能分析儀，輔助呼吸并監(jiān)測(cè)心率。 開(kāi)胸暴露心臟及大血管，分離升主動(dòng)脈，血管夾鉗夾主動(dòng)脈根部，微栓塞球0.1 mL（3×104個(gè)/mL，混懸于含十二磺基硫酸鈉的生理鹽水）經(jīng)注射器由心尖部迅速注射至左心室，夾閉時(shí)間為10 s，待呼吸、心率正常后逐層關(guān)胸，自主呼吸恢復(fù)后拔管脫機(jī)。 將術(shù)后存活30 只大鼠隨機(jī)分為單純微栓塞組（CME 組）和吡格列酮預(yù)處理組（PIO 組），每組15 只。 另以等量生理鹽水替代微栓塞球行左心室注射的15 只大鼠為假手術(shù)組（S 組）。 PIO組術(shù)前連續(xù)7 d 給予吡格列酮10 mg/kg 灌胃，1 次/d。術(shù)畢所有動(dòng)物均常規(guī)腹腔注射青霉素預(yù)防感染，飼養(yǎng)12 h 后處死。

1.3 RT-PCR 定量測(cè)定白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10 及TNF-α mRNA 表達(dá)

取心室組織0.2 g 并按Trizol 試劑盒說(shuō)明操作提取心室肌總RNA，用Nanodrop 測(cè)量濃度后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)示RNA 無(wú)降解后，調(diào)整RNA 濃度至1 μg/μL，行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR GREEN Ⅰ熒光標(biāo)記法檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，反應(yīng)體系為20 μL。本實(shí)驗(yàn)特異性引物均由上海生工生物公司合成：IL-6 （229 bp）：上游：5'-CTGCTCTGGTCTTCTGGAGT-3'，下游：5'-GGTCTTGGTCCTTAGCCACT-3'。 IL-10（572 bp）：上 游：5'-ACGCTGTCATCGATTTCTC-3'， 下 游：5'-GCAAGTGAAAGGACACCAT-3'。 TNF-α（460 bp）上游：5'-TGGCCCAGACCCTCACA-3'， 下游：5'-TGCCCGGACTCCGTGAT-3'。 GAPDH（223 bp）：上 游：5'-GGCATTGCTCTCAATGACAA -3'， 下 游：5' -TGTGAGGGAGATGCTCAG-3'。 反應(yīng)條件：94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)40 次。

1.4 Western blot 檢測(cè)TNF-α 表達(dá)

取心室肌組織0.5 g 以液氮研磨法研磨組織，轉(zhuǎn)移至EP 管， 加入蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑，4℃下12 000 r/min 離心20 min，抽取上清液用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。 然后取50 μg 蛋白樣品，配制15%分離膠和5%濃縮膠， 聚丙烯酰胺凝膠電泳， 半干法轉(zhuǎn)膜35 min；含5%脫脂奶粉TBST 緩沖液封閉1 h；1︰200一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜后以相應(yīng)二抗孵育1 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示抗原-抗體復(fù)合物， 暗室膠片顯影。用GelDoc 凝膠成像系統(tǒng)掃描。選擇GAPDH 蛋白作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表達(dá)水平比較

與S 組 比 較，CME 組 與PIO 組IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表達(dá)水平均升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與CME 組比較，PIO 組IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平下降，IL-10 mRNA 表達(dá)水平升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10 與TNF-α mRNA 表達(dá)水平比較

表1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10 與TNF-α mRNA 表達(dá)水平比較（s）

表1 各組大鼠心肌IL-6、IL-10 與TNF-α mRNA 表達(dá)水平比較（s）

注：與S 組比較，*P ＜0.05；與CME 組比較，#P ＜0.05；IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-10：白細(xì)胞介素-10；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；S：假手術(shù)；CME：冠狀動(dòng)脈微栓塞；PIO：吡格列酮

?

2.2 各組大鼠心肌TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較

與S 組（0.61±0.20）比較，CME 組（1.74±0.34）與PIO 組（1.21±0.46）的TNF-α 蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；CME 組與PIO 組的TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）。 見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 各組大鼠心肌TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較

CME 發(fā)生后急性期易發(fā)生心肌損傷， 病理特征為局部微小心肌梗死灶，伴隨心肌標(biāo)志物以及炎性因子升高，表現(xiàn)為灌流-收縮功能不匹配，冠脈血流儲(chǔ)備下降，血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定及惡性心律失常[7]。 CME 是影響ACS 患者預(yù)后及死亡率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[1]。Skyschally 等[2]發(fā)現(xiàn)，心肌組織微梗死灶引起的炎性反應(yīng)是CME 急性期導(dǎo)致心肌損傷的因素。

CME 后心肌炎癥損傷的顯著生化改變?yōu)檠仔砸蜃颖磉_(dá)上調(diào)，且炎性因子對(duì)心肌收縮舒張功能起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[8]。筆者在前期研究已證實(shí)，CME 發(fā)生后3 h，心肌組織局部炎性因子表達(dá)水平開(kāi)始明顯升高并于12 h 達(dá)到高峰[9]。 因此，本研究選擇對(duì)CME 后炎性因子觀察時(shí)間點(diǎn)為12 h。

在正常生理情況下，TNF-α、 白介素等炎性因子在心臟中含量極微，僅由內(nèi)皮細(xì)胞及位于心肌組織間質(zhì)的巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生；在應(yīng)激損傷刺激等特殊狀態(tài)下，心肌細(xì)胞本身也可表達(dá)多種炎性因子。 研究發(fā)現(xiàn)，CME 后急性期顯著升高的炎性因子，主要由應(yīng)激狀態(tài)心肌細(xì)胞本身分泌產(chǎn)生[10]。 TNF-α 是CME致心肌損傷的重要細(xì)胞因子。 急性期上調(diào)的TNF-α可直接抑制心臟收縮功能，激活中性粒細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)其表達(dá)黏附分子，引起中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞在受損心肌組織局部募集，導(dǎo)致心肌組織炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。IL-6 是另一個(gè)重要的炎癥因子，Nessler 等[12]研究證實(shí)，心肌缺血后IL-6 表達(dá)增加，促進(jìn)氧化應(yīng)激，直接介導(dǎo)炎性反應(yīng)。 表達(dá)上調(diào)的TNF-α 與IL-6 對(duì)缺血后心肌炎性反應(yīng)起協(xié)同反應(yīng)作用，兩者能破壞心肌微血管完整性，降低一氧化氮合成酶活性及腺苷生成，進(jìn)一步加重微循環(huán)損傷[13]。 本研究檢測(cè)心肌組織IL-6 與TNF-α 水平，從生化角度間接反映CME 后炎性反應(yīng)及心肌損傷程度。 本實(shí)驗(yàn)中，大鼠CME 發(fā)生后心肌組織TNF-α 與IL-6 升高，客觀反映了CME 后12 h 心肌損傷情況，CME 組較PIO 組心肌炎癥損傷更嚴(yán)重， 提示吡格列酮對(duì)CME后心肌損傷有一定的保護(hù)作用。

IL-10 主要由Th2 與Treg 細(xì)胞分泌，在體內(nèi)能抑制白介素及TNF-α 等炎性因子表達(dá)， 起拮抗炎性反應(yīng)作用。 PPARγ 是屬于Ⅱ型核受體超家族成員的核轉(zhuǎn)錄因子，參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)，也調(diào)控體內(nèi)炎性反應(yīng)[14]。 研究表明，作為PPARγ 激動(dòng)劑的代表藥物，吡格列酮能減輕缺血/再灌注損傷， 保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮保護(hù)心肌效應(yīng)，且該效應(yīng)獨(dú)立于糖脂代謝的調(diào)控功能[3，15]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與S 組比較，CME 組 及PIO 組IL-10 mRNA 均上升， 提示CME 發(fā)生后體內(nèi)抗炎因子IL-10 基因受轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 PIO 組術(shù)前7 d 連續(xù)予10 mg/（kg·d）吡格列酮預(yù)處理，與CME 組比較，IL-6 mRNA、TNF-α mRNA 及 蛋 白 表 達(dá) 水 平 降 低，IL-10 mRNA 水平增高， 說(shuō)明吡格列酮減少CME 后急性期心肌組織炎性因子在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)。 較CME 組升高的IL-10 mRNA，提示吡格列酮可能通過(guò)一系列復(fù)雜機(jī)制上調(diào)抗炎因子的轉(zhuǎn)錄水平，起心肌保護(hù)作用。 研究表明，PPARγ 激動(dòng)劑能激活PI3K/Akt、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）等促生存通路、并抑制核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶等介導(dǎo)炎性反應(yīng)通路的激活而減輕炎性反應(yīng)[3，16]，但上述通路是否參與吡格列酮對(duì)CME 后心肌組織炎性因子的表達(dá)調(diào)控，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，吡格列酮預(yù)處理可通過(guò)下調(diào)炎性因子IL-6 與TNF-α 的表達(dá)， 升高抗炎細(xì)胞因子IL-10 水平，從而減少大鼠CME 后心肌組織炎性反應(yīng)，這種作用可能由PPARγ 介導(dǎo)，為防治CME 后心肌損傷提供新的思路， 深入研究PPARγ 激動(dòng)劑對(duì)炎性因子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制將具有重要價(jià)值。

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