帕立骨化醇對糖尿病腎病腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預作用研究

王來亮 羅群 蔡珂丹 周芳芳 高燕紅

帕立骨化醇對糖尿病腎病腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預作用研究

王來亮 羅群 蔡珂丹 周芳芳 高燕紅

目的 探討帕立骨化醇對糖尿病腎?。―KD）腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的作用及內(nèi)在機制。方法 將24只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為帕立骨化醇干預組（P組）、糖尿病腎病組（D組）和正常對照組（C組），每組各8只。P組和D組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素65mg/kg建立糖尿病腎病模型，造模成功后第2天P組腹腔注射帕立骨化醇（溶于丙二醇中）0.4μg/kg，3次/周，D組予等體積丙二醇；C組僅予等體積丙二醇。4周后測血、尿生化指標；進行腎臟病理學檢查；免疫組化及Western blot技術檢測腎組織E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖連蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）及Klotho的表達，并進行指標間的相關性分析。結(jié)果 D組大鼠血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）及24 h尿蛋白水平均高于C組，P組均低于D組（均P＜0.05）。C組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，無明顯病理改變；D組可見腎小管間質(zhì)局部炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞脫落，小管擴張，基底膜斷裂；P組腎小管間質(zhì)病理改變較D組減輕。D組大鼠腎組織E-cadherin與Klotho表達低于C組，而P組高于D組（均P＜0.05）；與C組比較，D組大鼠腎組織α-SMA、FN及TGF-β1表達增加，而P組表達均較D組減少（均P＜0.05）。Klotho表達與E-cadherin呈正相關（r=0.924，P＜0.05），而與α-SMA、FN及TGF-β1均呈負相關（r=-0.806、-0.623、-0.856，均P＜0.05）。結(jié)論 帕立骨化醇可抑制糖尿病腎病大鼠腎小管上皮EMT，其作用可能與增加腎組織Klotho表達，同時減少TGF-β1合成相關。

帕立骨化醇 糖尿病腎病 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化生長因子-β1 Klotho

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of parlicalcitol on tubular epithelial mesenchymal transition(EMT) and underlying mechanism in diabetic kidney disease(DKD). Methods DKD was induced by single intraperitoneal injection of 65 mg/kg streptozotocin(STZ)in 16 Sprague Dawley(SD)rats,then the animals were randomly divided into group P and group D with 8 in each.Rats in group P received intraperitoneal injection of paricalcitol(0.4μg·kg-1)in propylene glycol three times a week;rats in group D received intraperitoneal injection of same volume of propylene glycol;8 rats in group C served as normal control and received propylene glycol as in group D.Blood,urine and renal tissue samples were collected after 4 weeks intervention of paricalcitol or vehicles.Biochemical indexes were measured,renal tissue was examined histopathologically and the expression of E-cadherin,alpha-smooth muscle actin(α-SMA),fibronectin(FN),transforming growth factor-β1(TGF-β1)and klotho in renal tissue were measured with immunohistochemistry and Western blotting,respectively.In addition,the correlation among the indexes was analyzed. Results Scr,BUN and 24 h urine protein increased significantly in group D compared with group C,while decreased in group P compared with group D(all P＜0.05). Local inflammatory cell infiltration,tubular epithelial cell detachment,tubular expansion and basement membrane rupture were observed in group D,but attenuated in group P compared with group C.The expression of E-cadherin and klotho decreased,while α-SMA,FN and TGF-β1 increased in group D compared with group C(all P＜0.05).Compared with D,the expression of E-cadherin and klotho increased,while α-SMA,FN and TGF-β1 decreased in group P(all P＜0.05).The expression of klotho was negatively correlated with α-SMA,FN and TGF-β1,while was positively correlated with E-cadherin(r=-0.806,P＜0.05;r=-0.623,P＜0.05;r=-0.856,P＜0.05;r=0.924,all P＜0.05). Conclusion Paricalcitol can inhibit tubular EMT in DKD,which may be associated with its effect of upregulating Klotho expression,and inhibiting TGF-β1 synthesis.

【Key words】 ParicalcitolDiabetic kidney disease Epithelial mesenchymal transition TGF-β1 Klotho

糖尿病腎病為糖尿病患者主要的微血管病變之一，在我國已迅速上升為終末期腎?。‥SRD）的重要原因。在糖尿病腎病中，腎小管間質(zhì)改變，包括腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并非繼發(fā)于腎小球病變，而是其早期及原始特征之一[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，EMT與腎小管間質(zhì)纖維化密切相關[3-4]；伴隨著EMT，糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化不斷進展，最終可發(fā)展為ESRD[5]。Klotho與轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路的相互調(diào)控，共同參與了腎小管上皮EMT[6-8]。因此，通過調(diào)控腎組織Klotho的表達及TGF-β信號通路的傳導或可成為抑制糖尿病腎病腎小管上皮EMT的重要途徑。帕立骨化醇為新型的維生素D類似物，具有抑制腎小管間質(zhì)纖維化的作用[9]，但其對糖尿病腎病腎小管上皮EMT的作用及機制尚未闡明。筆者采用帕立骨化醇干預糖尿病腎病大鼠模型，以探討其對腎小管上皮EMT的作用及可能機制，最終為糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的防治提供新線索，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑 雄性Sprague Dawley（SD）大鼠24只，清潔級封閉群，體重200～220g，由浙江省動物中心提供，于寧波大學實驗動物中心飼養(yǎng)。兔抗Klotho多克隆抗體（美國Prosci公司），兔抗TGF-β1多克隆抗體、兔抗E-鈣粘蛋白（E-cadherin）多克隆抗體、兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體、兔抗纖連蛋白（FN）多克隆抗體及兔抗β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG熒光二抗（美國Odyssey公司），鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司），帕立骨化醇（美國Abbott公司），免疫組化檢測試劑盒（武漢博士德），DAB顯色試劑盒（武漢博士德）。

1.2 動物模型的建立與分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表發(fā)分為帕立骨化醇干預組（P組）、糖尿病腎病組（D組）、正常對照組（C組），各8只。P組和D組大鼠禁食12h后單次無菌腹腔注射1%STZ（65mg/ kg）。1%STZ溶液臨用前用0.1mmol/L檸檬酸-檸檬酸二鈉緩沖液（pH=4.5）配制，30 min內(nèi)注射完畢。72h后夜間禁食≥8h，晨起斷尾取血測空腹血糖，空腹血糖≥16.7mmol/L并能維持1周確定為糖尿病模型；3周后測尿蛋白≥30mg/24h確定為糖尿病腎病造模成功。16只大鼠糖尿病腎病造模全部成功。P組：帕立骨化醇溶于丙二醇中，于造模成功后第2天腹腔注射0.4 μg/kg，3次/周，連續(xù)4周；D組：于造模成功后第2天給予等體積的丙二醇腹腔注射；C組：按D組方法腹腔注射丙二醇。

1.3 標本收集 連續(xù)干預4周后大鼠禁食≥8h，代謝籠收集24h尿液，記錄尿量后留取樣品5ml，2 000r/min離心10min，取上清液待檢。用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后處死大鼠，心臟采血3～5ml，3 500r/min離心10min，留取血清待檢。采血后立即開腹取雙腎，清除腎蒂結(jié)締組織及腎臟包膜，縱向剖開腎臟：取部分組織置于4%多聚甲醛溶液固定24h，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋；其余腎組織用液氮凍存。

1.4 生化指標檢測 血糖采用快速血糖儀檢測；血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、24h尿蛋白、血鈣、血磷及全段甲狀旁腺激素（iPTH）采用美國Beckcoulter Uni－Cel DxC 800 Synchron全自動生化分析儀檢測。

1.5 腎臟病理學檢查 腎組織石蠟切片（厚3～4μm），進行常規(guī)HE染色。光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 免疫組化 腎組織石蠟切片（厚3～4μm），脫蠟、水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復抗原，5%BSA封閉；分別滴加Klotho（1∶300）、TGF-β1（1∶200）、E-Cadherin（1∶200）、α-SMA（1∶100）和FN（1∶100）一抗，4℃孵育過夜；滴加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，顯微鏡下控制DAB顯色；蘇木素復染，脫水、透明并封片。采用PBS替代一抗作陰性對照；Image-pro plus 6.0圖像分析軟件對蛋白的表達進行半定量分析：每張切片隨機選取10個不重復視野（×200），分別檢測每個視野中指標的陽性區(qū)積分光密度（IOD），并取IOD均值作為陽性物質(zhì)的相對表達量。

1.7 Western blot 取液氮凍存的腎組織，加適量裂解液后充分研磨，4℃裂解組織，12 000g低溫離心2min，取上清液，BCA法測蛋白濃度；取總蛋白30μg，100℃加熱變性5 min后上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%BSA室溫封閉2h，加入Klotho（1∶400）、TGF-β1（1∶200）、E-cadherin（1∶200）、α-SMA（1∶200）和FN（1∶200）一抗，4℃孵育過夜；加熒光標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫反應1h后，采用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像，并測量條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用Stata 12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析；相關性分析采用Pearson直線相關。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標的比較 糖尿病腎病第4周，D組空腹血糖水平顯著高于C組（P＜0.05），但與P組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；D組Scr、BUN及24 h尿蛋白水平均高于C組和P組（均P＜0.05）；與C組比較，D組血磷與iPTH水平均上升，血鈣水平下降，但P組血磷與iPTH水平均低于D組，血鈣水平高于D組（均P＜0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠生化指標的比較

2.2 各組大鼠腎臟病理學檢查結(jié)果的比較 C組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，無明顯病理改變；D組可見腎小管間質(zhì)局部炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞脫落，小管擴張，基底膜斷裂；P組腎小管間質(zhì)病理改變較D組減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學改變（A：C組；B：D組；C：P組；HE染色，×200）

2.3 各組大鼠腎組織E-cadherin、α-SMA及FN表達的比較 免疫組化結(jié)果顯示：與C組比較，D組腎小管E-cadherin表達下調(diào)，IOD降低（P＜0.05），而腎小管間質(zhì)α-SMA與FN表達上調(diào)，IOD升高（均P＜0.05）；與D組比較，P組E-cadherin表達上調(diào)，IOD升高（P＜0.05），而α-SMA與FN的表達下調(diào)，IOD降低（均P＜0.05），詳見圖2。Western blot結(jié)果顯示：D組腎組織E-cadherin較C組顯著減少（0.78±0.10、1.06±0.10，P＜0.05），而α-SMA與FN表達增加（0.77±0.08、0.24±0.10，0.83±0.06、0.64±0.05，均P＜0.05）；與D組比較，P組E-cadherin表達增加（0.92±0.05、0.78±0.10，P＜0.05），而α-SMA及FN表達減少（0.55±0.10、0.77±0.08，0.75± 0.04、0.83±0.06，均P＜0.05），詳見圖3。

2.4 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達 免疫組化結(jié)果顯示：與C組比較，D組腎小管間質(zhì)TGF-β1表達上調(diào)，IOD升高（P＜0.05）；而P組TGF-β1表達較D組下調(diào)，IOD降低（P＜0.05），見圖4。Western印跡結(jié)果顯示：與C組比較，D組腎組織TGF-β1表達增加（0.69± 0.05、0.38±0.06，P＜0.05），而P組較D組表達減少（0.55±0.06、0.69±0.05，P＜0.05），見圖5。 2.5 各組大鼠腎組織Klotho表達的比較 免疫組化結(jié)果顯示：C組Klotho在腎小管呈高表達，IOD升高；與C組比較，D組腎小管Klotho表達顯著下調(diào)，IOD降低（P＜0.05）；而P組Klotho表達較D組上調(diào)，IOD升高（P＜0.05），見圖6。Western印跡結(jié)果顯示：與C組比較，D組腎組織Klotho表達減少（0.65±0.10、1.04±0.04，P＜0.05），而P組較D組表達增加（0.95±0.04、0.65± 0.10，P＜0.05），見圖7。

2.6 腎組織Klotho表達與E-cadherin、α-SMA、FN及TGF-β1表達的相關性分析 相關性分析發(fā)現(xiàn)，Klotho與E-cadherin呈正相關（r=0.924，P＜0.05），而與α-SMA、FN及TGF-β1呈負相關（r=-0.806、-0.623、-0.856，均P＜0.05）。

3 討論

早在20年前，在抗腎小管基底膜病動物模型中，研究發(fā)現(xiàn)小管上皮細胞可表達纖維化特異性標志蛋白——成纖維細胞特異蛋白-1（FSP-1），首次揭示了EMT與腎臟纖維化的內(nèi)在聯(lián)系[10]。在5/6腎切除動物模型中也發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞EMT可促進小管間質(zhì)纖維化[3]。之后，在UUO動物模型中，利用基因標記的方法明確肯定了近端腎小管上皮細胞EMT在慢性腎臟病進展中的作用。研究表明，腎小管間質(zhì)中高達36%的成纖維細胞源于近端小管上皮細胞EMT[4]。類似動物模型，在不同腎臟病患者的腎活檢組織中均存在腎小管上皮細胞EMT，表現(xiàn)為部分上皮細胞出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化，且與Scr水平及小管間質(zhì)纖維化相關[11-12]。

圖2 各組大鼠腎組織E-cadherin、α-SMA及FN的表達（A：免疫組化，×200；B：IOD；注：與C組比較，*P＜0.05；與D組比較，△P＜0.05）

在糖尿病腎病中，腎小管間質(zhì)改變，包括EMT，并非繼發(fā)于腎小球病變，而是早期病變及原始特征之一，無論從發(fā)病時間還是發(fā)病機制，腎小管病變有其獨立性，且腎小管病變和腎間質(zhì)纖維化對腎功能的預后較腎小球病變更為重要[1-2]。伴隨著EMT，糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化不斷進展，最終可發(fā)展為ESRD[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病第4周大鼠腎小管上皮標志蛋白E-cadherin表達減少，而間充質(zhì)標志蛋白α-SMA及FN表達增加，提示腎小管上皮正發(fā)生EMT，與之前報道一致[13]。此外，本研究中糖尿病腎病大鼠伴有不同程度的腎小管間質(zhì)形態(tài)學改變。值得注意的是，糖尿病腎病大鼠經(jīng)帕立骨化醇連續(xù)干預4周后，大鼠腎小管上皮EMT及小管間質(zhì)改變減輕，同時伴腎功能改善，且未發(fā)生高鈣血癥，表明帕立骨化醇治療可改善糖尿病腎病腎臟預后。

圖3 各組大鼠腎組織E-cadherin、α-SMA及FN的表達

在腎臟疾病中，多種因素可誘導腎小管上皮EMT的發(fā)生，包括低氧環(huán)境、活性氧（ROS）、血管活性因子、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、促纖維化細胞因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等。其中，TGF-β1是促進腎小管上皮EMT的主要因子之一[14-15]。Burns等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導腎小管上皮細胞（NRK-529）發(fā)生EMT，E-cadherin、α-SMA及波形蛋白表達水平相應改變；與之對應，在糖尿病腎病大鼠模型中，TGF-β1水平升高，上皮標志蛋白E-cadherin表達減少，而間充質(zhì)標志蛋白α-SMA與膠原蛋白表達增加。此外，在其他多項研究中均證實了此結(jié)果[16-17]。本研究中，糖尿病腎病第4周大鼠腎組織TGF-β1的表達增加，伴E-cadherin表達減少，α-SMA及FN表達增加；而帕立骨化醇干預后，腎組織TGF-β1的表達減少，同時伴EMT相關蛋白的表達逆轉(zhuǎn)。此結(jié)果提示，帕立骨化醇干預可通過減少TGF-β1的表達，從而抑制糖尿病腎病腎小管上皮EMT。

圖4 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達（A：C組；B：D組；C：P組；免疫組化，×200；與C組比較，*P＜0.05；與D組比較，△P＜0.05）

圖5 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達

圖6 各組大鼠腎組織Klotho蛋白的表達（A：C組；B：D組；C：P組；免疫組化，×200；與C組比較，*P＜0.05；與D組比較，△P＜0.05）

圖7 各組大鼠腎組織Klotho的表達

此外，CKD患者早期即可出現(xiàn)Klotho缺乏[18]，而影響Klotho基因表達的一個關鍵因素就是高糖環(huán)境[19]。體內(nèi)外研究表明，高糖降低腎臟Klotho表達水平，而降糖可逆轉(zhuǎn)Klotho表達[19]。Klotho缺乏與腎小管間質(zhì)纖維化密切相關。研究表明，在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）動物模型中，腎臟Klotho缺乏可加重腎小管間質(zhì)纖維化，TGF-β1、α-SMA及FN表達明顯增加[7]；而外源性Klotho可抑制腎小管間質(zhì)纖維化，這可能與Klotho直接與TGF-β1Ⅱ型受體結(jié)合從而抑制TGF-β1信號通路的傳導有關[7-8]?？梢姡琄lotho缺乏可促進腎小管間質(zhì)纖維化，而抑制TGF-β1的表達及其信號通路的傳導可能是其內(nèi)在機制之一。值得注意的是，TGF-β1的表達除了受Klotho調(diào)控外，本身還可抑制組織對Klotho的表達[7-8]。本研究結(jié)果顯示，在糖尿病腎病第4周，大鼠腎組織Klotho表達明顯減少，同時伴TGF-β1表達增加，而予帕立骨化醇干預后，可逆轉(zhuǎn)腎組織Klotho及TGF-β1的表達。此結(jié)果提示，在糖尿病腎病狀態(tài)下，帕立骨化醇可通過促進腎組織Klotho的表達，從而抑制TGF-β1介導的腎小管上皮EMT及腎臟纖維化。

總之，糖尿病腎病中Klotho及TGF-β信號通路相互調(diào)控，而Klotho表達水平下降引起TGF-β1合成增加是導致腎小管上皮EMT的重要機制。因此，通過調(diào)控腎組織Klotho表達，從而抑制TGF-β1合成，成為帕立骨化醇阻斷腎小管上皮EMT及小管間質(zhì)纖維化的內(nèi)在途徑之一。但目前帕立骨化醇對腎臟Klotho表達的調(diào)控機制尚未闡明，可能是由多個維生素D反應元件（VDREs）介導[20]，仍需進一步研究。

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Effect of paricalcitol on tubular epithelial mesenchymal transition in diabetic kidney disease

WANG Lailiang,LUO Qun,CAI Kedan,et al.
Department of Nephrology,Ningbo Second Municipal Hospital,Ningbo 315010,China

2014-12-15）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（2015KYA201）；寧波市自然科學基金（2014A610245）

315010 寧波市第二醫(yī)院腎內(nèi)科

羅群，E-mail：nbluoqun@163.com