我國東部6個鴨兒芹群體遺傳多樣性的ISSR分析

劉小慧，孫兵，婁玉霞，郭水良

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

我國東部6個鴨兒芹群體遺傳多樣性的ISSR分析

劉小慧，孫兵，婁玉霞，郭水良

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

基于ISSR分子標(biāo)記，對采自浙江磐安大盤山、臨安清涼峰、臨安昌化、金華北山雙龍洞附近、金華北山朝真洞附近和上海奉賢(栽培)的6個鴨兒芹(Cryptotaenia japonicaHassk.)群體的70個樣本進(jìn)行了遺傳多樣性分析.從9條篩選出的ISSR引物共擴(kuò)增出149條帶，其中136條具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶百分率為91.28%.基于ISSR標(biāo)記計算了6個鴨兒芹群體的遺傳多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)它們的Nei的基因多樣性指數(shù)(H)為0.1971，Shannon信息多態(tài)性指數(shù)(I)為0.3086，Nm指數(shù)為0.3343.6個群體遺傳分化系數(shù)Nm為0.5993，表明59.93%的遺傳分化存在于群體間，40.07%的遺傳分化存在于群體內(nèi)，群體群體間的基因流為0.3237，表明供鴨兒芹群體之間基因流較小，遺傳漂變已造成鴨兒芹群體之間較強(qiáng)的遺傳分化.基于136個位點(diǎn)，構(gòu)建了反映各樣本間遺傳親緣關(guān)系的系統(tǒng)聚類圖，結(jié)果表明，從70個樣本中可以區(qū)分出5個類群，其中金華北山采的兩個群體為一個類群，與地理位置有很強(qiáng)的對應(yīng)性.因此，在今后的鴨兒芹引種栽培時，應(yīng)注意從不同產(chǎn)地的鴨兒芹種源中進(jìn)行引種，以豐富栽培種的遺傳多樣性.

鴨兒芹；ISSR分子標(biāo)記；聚類分析；遺傳多樣性

0 引言

鴨兒芹(Cryptotaenia japonicaHassk.)，又稱作鴨腳板、三葉芹，傘形科多年生草本植物，因質(zhì)地柔嫩可以食用葉莖，同時也具有較高的藥用價值和保健功能［1-2］.典型的形態(tài)特征：多年生草本植物，全株無毛，株高30～60 cm，有香氣，葉三出，有長柄，葉基部呈鞘狀，中央小葉呈菱狀廣卵形，兩側(cè)小葉呈現(xiàn)歪卵形，小葉無柄，先端尖，邊緣具不整齊的銳尖重鋸齒.7～8月抽生出50～60 cm長的花梗，傘形花序圓錐狀，小傘梗少數(shù)，不等長，花白色，花瓣披針形.果實為長橢圓形雙懸果，9～10月陸續(xù)成熟，果皮由綠色變成黃褐色.種子黃褐色，長紡錘形，有縱溝，千粒質(zhì)量2.25～2.50 g［3］.

目前國內(nèi)對鴨兒芹分子方面的研究相對很少，特別是在遺傳多樣性方面，前人主要研究了鴨兒芹氨基酸、揮發(fā)油成分等.鴨兒芹在我國分布廣泛，主要在浙江、湖南、江西等地，不同地區(qū)鴨兒芹種群的遺傳分化如何值得研究.ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記是基于微衛(wèi)星技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有產(chǎn)物特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物的品種鑒定、分類與進(jìn)化、遺傳作圖、基因定位等諸多領(lǐng)域［4］.本試驗利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對6個鴨兒芹群體進(jìn)行遺傳多樣性分析.這方面工作將為鴨兒芹的良種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為來自浙江金華北山雙龍洞周圍和朝真洞附近、清涼峰、大盤山、昌化、上海奉賢(栽培群體)6個群體.采樣時每兩株樣本間的距離在10 m以上.取材后統(tǒng)一自然風(fēng)干保存.

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測

取每個地點(diǎn)的干燥供試材料鴨兒芹葉片，每份材料重約0.2 g，利用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司產(chǎn)品)提取DNA.取5 μL DNA溶液用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度檢測，電泳緩沖液為1×TAE Buffer，電泳30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)儀照相.最后將各材料的DNA濃度稀釋至20 ng/μL備用.

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)體系：2×Es Taq MasterMix：12.5 μL(康為世紀(jì)公司產(chǎn)品)，Primer(10×)：1 μL，Template DNA：2 μL，RNase-Free Water：9.5 μL；擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；退火(退火溫度根據(jù)引物而定)30 s；72℃延伸30 min；30個循環(huán)；72℃終延伸5 min后終止反應(yīng).取3 μL的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖膠中進(jìn)行電泳，電壓為80 V，電泳時間40 min，并照相記錄.

1.2.3 引物篩選

以金華北山1號和清涼峰基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR適宜引物篩選，試驗所用哥倫比亞大學(xué)設(shè)計并公布的90條ISSR常用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.共篩選出9個合適的引物，并對其中的3個引物進(jìn)行了溫度梯度篩選PCR.

1.2.4 ISSR標(biāo)記的數(shù)據(jù)處理

通過凝膠成像系統(tǒng)片拍攝照片，然后用TanonGIS軟件進(jìn)行條帶的標(biāo)記，記錄下膠板上相對較為清晰的條帶，按照試驗中點(diǎn)樣的順序逐條比對多態(tài)性帶，如果存在有差異譜帶的位置及時進(jìn)行記錄，有帶的則記作1，無帶的則對應(yīng)記作0，生成0，1組成的數(shù)矩陣，根據(jù)9條引物的擴(kuò)增結(jié)果，運(yùn)用了R語言中的聚類分析函數(shù)，以Jaccard系數(shù)作為遺傳距離，采用離差平方和法作為聚類策略，構(gòu)建出了70個樣本親緣關(guān)系樹狀聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨兒芹葉片基因組提取

由圖1可知(清涼峰群體提取的DNA)，鴨兒芹的6個地點(diǎn)的基因組DNA的電泳條帶均勻、清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明通過植物基因組試劑盒法所提取的鴨兒芹DNA純度很高，可以用來進(jìn)行ISSR分析.

圖1 清涼峰鴨兒芹群體提取的基因組DNA

2.2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

以金華北山兩個群體的基因組DNA為模板，從哥倫比亞大學(xué)設(shè)計并公布的90個引物中篩選出穩(wěn)定性好、均勻、條帶清晰且多態(tài)性豐富的適宜引物有9個，用于品種間的ISSR比較分析(表1、圖2).9個引物共計擴(kuò)增出了149條清晰可辨的條帶，DNA片段長度多在250～2000 bp，平均每個引物擴(kuò)增出16.56條，其中136條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶百分率為91.28%.

Nei的基因多樣性指數(shù)(H)為0.1971，Shannon信息多態(tài)性指數(shù)(I)為0.3086.5個群體Nei的遺傳分化系數(shù)Gst=0.5993，表明59.93%的遺傳分化存在于群體間，40.07%的遺傳分化存在于群體內(nèi)，觀察等位基因數(shù)1.9128，有效等位基因數(shù)1.3258，群體群體間的基因流Nm為0.3343，表明供鴨兒芹群體之間存在很小的基因流，說明基因的遺傳漂變已造成鴨兒芹群體之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的遺傳分化，在DNA分子水平上鴨兒芹種質(zhì)材料存在著豐富的遺傳多樣性.

表1 供試鴨兒芹的采集地信息

圖2 ISSR引物UBC827(哥倫比亞大學(xué)設(shè)計90條引物之一)對金華的樣本PCR的結(jié)果

多樣性指數(shù)通常用來表示群體內(nèi)和群體間遺傳變異程度，鴨兒芹群體的遺傳多樣性各指數(shù)見表2.Shannon多樣性指數(shù)(I)的結(jié)果顯示不同群體鴨兒芹群體內(nèi)的遺傳多樣性存在著一定的差異，其變化范圍為0.0593～0.2273，其中最高的是清涼峰0.2273，其次是大盤山0.1395，接著是昌化0.1134，金華朝真洞0.0866，金華雙龍洞0.0752，最低的是栽培0.0593，6個群體平均多樣性指數(shù)為0.1168.

鴨兒芹群體的Nei基因多樣性(H)在0.0385～0.1473之間變化，其中清涼峰的最高，為0.1473，其次是大盤山的群體0.0926，接著是昌化的0.0777，金華朝真洞的0.0607，金華雙龍洞的0.0517，最低的是栽培0.0385，6個群體的平均基因多樣性指數(shù)為0.0781.表3表明，各群體的Nei基因多樣性(H)與Shannon多樣性指數(shù)(I)比較一致，均表明遺傳多樣性最高的是清涼峰，其次是磐安大盤山和臨安昌化，接著是金華山朝真洞附近和雙龍洞附近的群體，最后則是上海奉賢栽培群體.

表2 基于ISSR標(biāo)記鴨兒芹六個群體的遺傳多樣性

2.3 樣本間親緣關(guān)系分析

基于ISSR標(biāo)記的6個鴨兒芹群體的遺傳距離見表3.鴨兒芹6個群體間遺傳一致度在0.7807～0.9743之間變化，其平均值為0.8775，其中金華朝真洞和金華雙龍洞群體在遺傳上的相似性最大，為0.9743；金華雙龍洞和清涼峰群體的遺傳相似性相對較小，為0.7807，說明鴨兒芹各群體間的相似程度較高.

表3 基于ISSR標(biāo)記的6個鴨兒芹群體的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

對70份鴨兒芹樣本進(jìn)行了ISSR標(biāo)記分析，根據(jù)Jaccard遺傳相似系數(shù)，應(yīng)用組平均法得到的聚類分組圖(圖3)，從圖3上可將70份鴨兒芹植物樣本分為5個組.組1、2、3、4分別對應(yīng)于大盤山群體、清涼峰群體、上海奉賢栽培群體和臨安昌化群體，組5由浙江金華北山的兩個群體組成.基于ISSR數(shù)據(jù)的70份樣本聚類結(jié)果重排距離矩陣熱圖如圖4所示.從圖4可以發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的鴨兒芹群體遺傳分化十分明顯，與地理位置有極強(qiáng)的對應(yīng)性.

圖3 基于應(yīng)用Jaccard系數(shù)和組平均法策略的70份樣本圓形聚類樹狀圖

圖4 基于ISSR數(shù)據(jù)的70份樣本聚類結(jié)果重排距離矩陣熱圖

3 討論

ISSR分子標(biāo)記利用了15～24個堿基的重復(fù)錨定引物擴(kuò)增ISSR之間的片段，具有操作簡單、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)［5-13］.通過試驗可得到ISSR擴(kuò)增反應(yīng)會受到諸多因素的影響：Mg2+濃度、引物的濃度、TaqDNA聚合酶、模板DNA濃度與純度等，這些因素的改變也會影響到擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定性.試驗的過程中通過嚴(yán)格控制試驗條件進(jìn)行了多次試驗反復(fù)篩選，最終得到了重復(fù)性好、穩(wěn)定、清晰的ISSR擴(kuò)增條帶.試驗結(jié)果中利用篩選出的9個適宜引物對6個供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出149條帶，其中136條具多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為91.28%，表明供試材料間存在豐富的多態(tài)性.多態(tài)性比率高則說明這個群體或是物種的遺傳分化程度較高，對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng).分子標(biāo)記中，當(dāng)擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)超過70個時就基本上可以反映樣本DNA的多樣性信息［14］，本試驗中9條引物共擴(kuò)增出136條多態(tài)性條帶，可以說基本上可以反映出鴨兒芹的遺傳多樣性狀態(tài).

植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)反映了種的長期進(jìn)化史，例如分布區(qū)變化、生境片斷化和居群特化、突變、遺傳漂變、交配系統(tǒng)、基因流和選擇等不同過程的相互作用［15］.在影響物種遺傳結(jié)構(gòu)的各個生活史特征中，物種的繁育系統(tǒng)對其遺傳多樣性高低和結(jié)構(gòu)影響較大.基因流的強(qiáng)弱對居群分化具有重要影響.一般認(rèn)為，當(dāng)Nm＞1時，基因流就可以防止由遺傳漂變引起的居群之間的遺傳分化.因此，在影響鴨兒芹遺傳變異方面，基因流比遺傳漂變起著重要的作用.一般廣布種植物的基因流(Nm=1.881)，而鴨兒芹的Nm值僅為0.3343，有限的基因流是導(dǎo)致鴨兒芹遺傳分化的原因之一.

不同物種由于繁育系統(tǒng)上的差異，群體間的遺傳分程度不同.例如來自寧波、杭州、南京、滁州、合肥、安慶和彭澤地區(qū)的7個明黨參(Changium smyrnioidesWolff.)群體之間的Gst為57.7%［16］，這與本研究中鴨兒芹的群體之間的該值相近；而長梗合被韭(Allium neriniflorumL.)的群體之間的Gst僅為42.18%，明顯地比鴨兒芹的低［17］.

群體間親緣關(guān)系研究和遺傳多樣性分析對于植物育種具有重要的意義，全面地掌握現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以減少育種工作中親本選配的盲目性［9］.因此，人們在經(jīng)濟(jì)植物，例如一些中藥材的種質(zhì)保育方面較多地應(yīng)用這些方法.例如，隋春等建立了適于柴胡(Bupleurum chinenseDC)的ISSR分析體系，并采用ISSR技術(shù)分析了3份柴胡栽培種質(zhì)個體間及種間的差異［18］.劉義梅［19］等認(rèn)為白花前胡(Peucedanum praeruptorumDunn)種質(zhì)資源遺傳變異豐富，遺傳關(guān)系與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性，但不是嚴(yán)格按地理來源進(jìn)行聚類.

在實際的應(yīng)用過程中可以可將ISSR分析結(jié)果直接應(yīng)用到鴨兒芹的選育工作中，選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料，增加后代的遺傳變異，選育出雜交優(yōu)勢強(qiáng)、綜合性狀好的優(yōu)良品種［9］.而且根據(jù)鴨兒芹的生物學(xué)以及生態(tài)學(xué)特性，它適應(yīng)于陰濕環(huán)境，種植于林下等遮蔽環(huán)境，可順利度過長江中下游地區(qū)6、7月間高溫高濕的“梅雨”季節(jié)［20］.

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Genetic diversity of six populations of Cryptotaenia japonica in Eastern China based on ISSR markers

LIU Xiaohui，SUN Bing，LOU Yuxia，GUO Shuiliang
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

Genetic diversity of six populations(including 70 individuals)ofCryptotaenia japonicaHassk，collected from Dapanshan of Pan＇an，Qinliangfeng of Lin＇an，Chanhua of Lin＇an，Beishan of Jinhua，Zhejiang，and Fengxian of Shanghai(cultivated population)were analyzed based on their ISSR markers.A total of 149 bands were amplified from nine selected primers，of which 136 were polymorphic，their percentage of polymorphic bands being 91.28%.Based on the ISSR markers of sixC.japonicapopulations，their Nei＇s genetic diversity index，Shannon information index，Nm index was 0.1971，0.3086，and 0.3237，respectively.Their genetic differentiation coefficient(GST)was 0.5993，indicating that 59.93%genetic differentiation exists among populations，and 40.07%genetic differentiation exists within populations.Their gene flow was 0.3343，indicating a low gene flow existed among different populations ofC.japonicain the studied areas，namely，a genetic drift has caused a strong genetic differentiation ofC.japonicaamong populations.Based on 136 locus information，a clustering dendrogram was constructed for the 70 individuals to reveal their genetic relationships.Based on the clustering analysis，the individuals could be divided into five groups，among them two populations collected from Jinhuashan were clustered into one group.The genetic differentiation among the five groups has a strong relationship with their geographical localities.Therefore in the future，it should be pay attention that introduce and cultivate Cryptotaonia japonica from different places of origin to enrich the genetic diversity of cultivated species.

Cryptotaenia japonica；ISSR molecular marker；cluster analysis；molecular marker

S 567

A

1000-5137(2015)06-0650-07

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.012

(責(zé)任編輯：顧浩然)

2015-09-25

上海市高校知識服務(wù)平臺-上海市植物種質(zhì)資源中心經(jīng)費(fèi)(ZF1205)

婁玉霞，中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，郵編：200234，E-mail：yuxialou@shnu.edu.cn