24份普通白菜遺傳多樣性的形態(tài)特征和RAPD分析

肖禾，王萌，崔麗潔，開國(guó)銀，潘靜嫻

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

24份普通白菜遺傳多樣性的形態(tài)特征和RAPD分析

肖禾，王萌，崔麗潔，開國(guó)銀，潘靜嫻

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

利用形態(tài)特征與RAPD分析技術(shù)，分析了國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的24份普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.)種質(zhì)的遺傳多樣性.結(jié)果表明，13個(gè)形態(tài)學(xué)性狀的變異系數(shù)為12.4%～69.9%，其中葉柄變異最大，子葉變異最小.24份普通白菜材料在形態(tài)學(xué)聚類的距離5處聚為4類.利用篩選出的15條RAPD引物從24份普通白菜材料中共擴(kuò)增出113條帶，其中多態(tài)性條帶83條，多態(tài)率73.4%，平均每條引物條帶7.53條、多態(tài)性條帶5.53條.RAPD數(shù)據(jù)聚類在相似系數(shù)0.77處，分為8類，與形態(tài)聚類間有重疊和細(xì)分.以形態(tài)聚類4個(gè)類別計(jì)算的Nei＇s基因多樣性指標(biāo)H和Shannon信息指數(shù)I，均為第Ⅳ大類＞第Ⅰ大類＞第Ⅲ大類＞第Ⅱ大類，第Ⅳ類的H和I分別為0.2395和0.3523.而不同地區(qū)則以江淮地區(qū)的Nei＇s基因多樣性H和Shannon信息指數(shù)I最高，分別為0.2076和0.3098.這些結(jié)果與普通白菜種質(zhì)資源多樣性特征以及地區(qū)分布相吻合.

普通白菜；形態(tài)特征；RAPD分析；聚類分析

普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.)為十字花科蕓薹屬蕓薹種小白菜(不結(jié)球白菜)亞種的一個(gè)主要變種［1-2］，屬異花授粉作物.授粉方式多樣，變種內(nèi)、種內(nèi)和種間雜交廣泛，因此，經(jīng)長(zhǎng)期選擇，就產(chǎn)生了復(fù)雜變異，形成了豐富的品種資源，表現(xiàn)為形態(tài)、習(xí)性、生態(tài)適應(yīng)性上的差異類型［3-4］；此外，不同生態(tài)環(huán)境下栽培，也可形成不同的群體［5］.為此，不結(jié)球白菜分類一直存在著廣泛的爭(zhēng)議，也使得品種繁多的普通白菜種質(zhì)資源的收集和整理存在一定難度，尤其是同種異名和同名異種的種質(zhì)更加難以確定其類別和地位.因此，進(jìn)行普通白菜種質(zhì)資源的鑒定對(duì)種質(zhì)的收集和保存意義重大.

種質(zhì)鑒定方法有形態(tài)學(xué)方法和分子標(biāo)記技術(shù)兩種類型［6-9］，形態(tài)學(xué)方法易受栽培技術(shù)和季節(jié)變化等影響，準(zhǔn)確性不高；分子標(biāo)記技術(shù)直接以DNA形式表現(xiàn)，有穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)［9-10］，已被廣泛用于紫珠［11］、溫郁金［12］、菠蘿［13］、油茶［14］、芹菜［15］、不結(jié)球白菜［16］等不同植物的種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析和圖譜構(gòu)建.目前在不結(jié)球白菜上進(jìn)行分子標(biāo)記取得了一定進(jìn)展［16-18］，侯喜林［19-21］等對(duì)我國(guó)南方廣泛種植的普通白菜、塌菜等不少品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析.宋廷宇［22］等對(duì)瀕于滅絕的薹菜進(jìn)行了RAPD和SSR分析，以保護(hù)正在流失的種質(zhì)資源.盡管前人已做了不少工作，但目前市場(chǎng)上品種混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，尤其是同名異種或異種同名現(xiàn)象非常普遍，因此進(jìn)行品種鑒定以理清品種間的親緣關(guān)系顯得十分必要.本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)性狀和RAPD分子標(biāo)記，對(duì)產(chǎn)自我國(guó)不同地區(qū)的不同類型的24份普通白菜種質(zhì)，進(jìn)行變種內(nèi)親緣關(guān)系的分析，以期為普通白菜種質(zhì)資源收集、保存、利用提供依據(jù)，也為已建成的普通白菜種質(zhì)資源庫(kù)［23］的修訂以及正在創(chuàng)建的不結(jié)球白菜種質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)提供正確信息.

1 材料與方法

1.1 植物材料

參試的普通白菜材料共計(jì)24份(表1)，分別標(biāo)記為1～24，全部為市場(chǎng)購(gòu)買.品種選擇考慮了產(chǎn)地、形態(tài)特征、播期等因素，盡量在適宜播期內(nèi)，品種的分布范圍盡可能代表普通白菜在國(guó)內(nèi)的分布區(qū)域，形態(tài)上要將各種特征包含在內(nèi)，如株型、葉色等.種子產(chǎn)地包括華東、華北、西北、華中、華南等地區(qū)的13個(gè)省份；株高有矮箕、中梗和高梗之分；葉色有墨綠、綠、淺綠類型；葉面有光滑、皺縮和帶毛類型.試驗(yàn)分2012年和2013年2個(gè)年度進(jìn)行，其中2012年為預(yù)備實(shí)驗(yàn).播種時(shí)間分別為2012年10月8日、2013年10月11日，露地穴播，穴距20 cm×15 cm，二葉一心期定植.小區(qū)面積9 m2，重復(fù)2次.正常田間管理.

表1 用于RAPD分析的普通白菜名稱及產(chǎn)地

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)特征調(diào)查

在正常收獲期(2013年為1月10日，2014年為1月14日)，調(diào)查24個(gè)品種的葉長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)、葉寬、葉柄寬、葉厚、葉柄厚、冠幅、株高、蓮座葉數(shù)等數(shù)量性狀和株型、葉形、葉緣、葉面、葉色、葉柄色等質(zhì)量性狀.每個(gè)小區(qū)取5株代表性的植株調(diào)查，重復(fù)2次.調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照［3］進(jìn)行.數(shù)量性狀數(shù)據(jù)按2年平均，質(zhì)量性狀取2年相同的表現(xiàn).

1.2.2 RAPD分子標(biāo)記操作

1.2.2 .1DNA提取

采用CTAB法提取.所用嫩葉取自2013年的田間植株，完成品種田間形態(tài)調(diào)查后，每份材料選取1～2 g嫩葉，放入冰盒中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置冰箱中保存，備用.

取適量(比指甲蓋稍大)葉片放入EP管，加適量石英砂，再加300 μL PVP+CTAB的混合液，研磨到看不見組織后，又加300 μL上述混合液研磨.在通風(fēng)櫥中加入6 μL巰基乙醇后，65℃水浴1 h (每隔15～20 min搖1次).水浴后，加600 μL苯酚-氯仿(1∶1)混合液，4℃12000 r/min離心20 min，分層.取上清液于EP管，輕搖，相同條件下離心.上清液移入約1 mL無水乙醇的EP管中，混勻，-20℃冰箱處理30～60 min，取出，4℃離心.倒去上清液，加600 μL 75%乙醇，4℃12000 r/min離心10 min.去掉上清液，殘液留到紙上，45～50℃烘干，10～15 min，無乙醇味道止.殘?jiān)?0 μL無菌水溶解，再加0.8 μL的RNAse，37℃水浴30 min，獲得DNA提取液，-20℃冰箱保存.電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度.

1.2.2 .2PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)所用120條引物和生化試劑全部購(gòu)自上海生物工程有限公司，引物按［18］的方法篩選，PCR體系和程序采用史公軍等［19］的方法.PCR反應(yīng)體系25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.9 μL，60 ng DNA模板1 μL，不足用ddH2O補(bǔ)足.PCR循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性2 min，37℃復(fù)性30 s，72℃延伸50 s，2個(gè)循環(huán)；94℃變性45 s，37℃復(fù)性30 s，72℃延伸50 s，18個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，94℃變性45 s，37℃復(fù)性30 s，72℃延伸50 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存.擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物10 μL，加溴酚藍(lán)指示劑，混勻后上樣電泳，1xTBE電泳緩沖液，1.6%瓊脂糖凝膠，EB1 μg/ mL，在凝膠60℃左右加入.電壓100 V，時(shí)間2 h.電泳結(jié)束后，取出膠，在FR-200紫外可見圖像分析儀中觀察、拍照和記錄.

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 形態(tài)數(shù)據(jù)

將田間采集的15項(xiàng)形態(tài)性狀數(shù)據(jù)分成2種，其中數(shù)量性狀計(jì)算實(shí)測(cè)值的平均值，質(zhì)量性狀按［6］進(jìn)行賦值處理和數(shù)量化，并用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)量化的性狀進(jìn)行多樣性分析和Q型聚類分析.

1.3.2 RAPD數(shù)據(jù)

統(tǒng)計(jì)分子量在200～3000 bp DNA的條帶，電泳圖譜上選擇清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好的條帶記為1，相同位置缺失的記為“0”，將數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，形成0/1矩陣.利用軟件NTSYSpc2.1e版分析0/1矩陣，SIMQUAL程序計(jì)算相似系數(shù)，UPGMA法聚類分析，生成樹狀圖［10］.

2 結(jié)果分析

2.1 形態(tài)特征分析

24份普通白菜品種的13份數(shù)量性狀多樣性分析顯示(表2)，數(shù)量性狀的變異系數(shù)為12.4%～69.9%，性狀多樣性表現(xiàn)較為豐富.變異由高到低的排列為葉柄長(zhǎng)、單株重、葉長(zhǎng)、子葉凹槽深、葉寬、葉柄寬、株幅、腰粗、菜頭粗、蓮座葉數(shù)、子葉寬、子葉長(zhǎng).其中葉柄長(zhǎng)的變異系數(shù)最大，達(dá)69.9%，說明該性狀變化較大，田間表現(xiàn)也支持了這一結(jié)果.性狀變異最小的為子葉長(zhǎng)和寬，說明各子葉期品種差異最小.

圖1 24份普通白菜種質(zhì)資源形態(tài)性狀的聚類分析樹狀圖

利用表2數(shù)據(jù)生成的Q型聚類分析樹狀圖(圖1)表明，在距離5處，24個(gè)品種分為4類，第一類10個(gè)品種，為5，17，9，18，6，24，1，2，21，15號(hào)，其中5，17，9，18號(hào)可歸為一小類，6，24，1，2，21，15號(hào)歸為另一小類.這類植株較矮，葉卵圓或近圓，株型開展或半直立.第二類僅7，22號(hào)2個(gè)品種.該類植株較高，葉窄細(xì)長(zhǎng)，葉披針形，株型開展.第三類為8，23，3，4，11號(hào)5個(gè)品種，其中8，23號(hào)；3，4號(hào)；11號(hào)有屬不同小類.這類株高冠幅適中，葉長(zhǎng)葉寬適中，半直立或直立株型.第四類為10，20，16，19，13，14，12號(hào)7個(gè)品種，其中10，20號(hào)與后5個(gè)品種歸為不同小類.這類冠幅大，葉闊長(zhǎng)，株型開展或半塌地.從采集地區(qū)來看，不同的類別與地域關(guān)系不大.上述聚類結(jié)果與24個(gè)品種的田間長(zhǎng)勢(shì)較為吻合.

表2 普通白菜數(shù)量性狀統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2 不同類型普通白菜的RAPD分析

2.2.1 不同類型普通白菜RAPD引物擴(kuò)增多態(tài)性

篩選出的15個(gè)RAPD隨機(jī)引物在24份普通白菜間共擴(kuò)增出113條帶，其中多態(tài)性帶83條，多態(tài)性比率為73.4%，平均每條引物擴(kuò)增出7.53條和5.53個(gè)多態(tài)性條帶.產(chǎn)生條帶最少的是引物S306和s1041，只有50%，最多的是引物S2001，比例為100%(表3，圖2).

表3 普通白菜RAPD引物PCR擴(kuò)增多態(tài)性

圖2 引物S2001(A圖)和S041(B圖)擴(kuò)增結(jié)果圖

2.2.2不同類型普通白菜的遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量種群變異和分布范圍的重要指標(biāo)，通常用Nei＇s基因多樣性指標(biāo)H和Shannon信息指數(shù)I來表示.按照普通白菜形態(tài)性狀聚類分成的Ⅰ～Ⅳ個(gè)普通白菜類型來計(jì)算15個(gè)引物擴(kuò)增后的Nei＇s和Shannon指數(shù)，其結(jié)果表明，H和I兩個(gè)指數(shù)均呈現(xiàn)相同特點(diǎn)，都是第Ⅳ大類＞第Ⅰ大類＞第Ⅲ大類＞第Ⅱ大類(表4).這就說明普通白菜形態(tài)性狀的主要類型，即第Ⅳ大類和第Ⅰ大類包含的17個(gè)品種，其等位基因的離散程度大，某一擴(kuò)增產(chǎn)物的存在頻率大，遺傳多樣性復(fù)雜.同時(shí)，該結(jié)果也與市場(chǎng)上這兩類普通白菜品種變異多，數(shù)量龐大高度吻合.

表4 不同類型普通白菜的遺傳多樣性

2.2.3 不同地區(qū)普通白菜的遺傳多樣性

普通白菜原產(chǎn)于中國(guó)，但在中國(guó)卻存在著明顯的地域性特點(diǎn).以24份試驗(yàn)品種的產(chǎn)地來源進(jìn)行的遺傳多樣性分析表明，15個(gè)引物擴(kuò)增后計(jì)算的Nei＇s和Shannon指數(shù)，江淮地區(qū)的普通白菜最大，其次為華中地區(qū)，最小為新疆(表5).這一結(jié)果與普通白菜的區(qū)域分布一致.從收集到的分布于全國(guó)各區(qū)域的313份(數(shù)據(jù)未全給出，本研究的24份是其中一部分)普通白菜種質(zhì)資源來看，江淮流域(主要統(tǒng)計(jì)江蘇、浙江、上海和安徽四省市)占45%，華中三省占11.2%，東北0.6%，新疆占0.9%，西北也只占4.7%.因此，普通白菜的遺傳多樣性在江淮地區(qū)最高，西北東北地區(qū)最低.

表5 不同地區(qū)普通白菜的遺傳多樣性

2.2.4 不同類型普通白菜的聚類分析

由RAPD數(shù)據(jù)矩陣，經(jīng)軟件分析獲得的UPMGA聚類樹狀圖(圖3)，圖3中可以看出，供試的24個(gè)普通白菜品種的遺傳相似性系數(shù)在0.69～0.89間，表明普通白菜的遺傳相似性較高.在相似系數(shù)為0.77處，24份普通白菜材料分為8個(gè)大類.第一類包括19號(hào)，第二類16號(hào)，第三類10號(hào)，第四類為13號(hào)、14號(hào)，第五類12號(hào)，第六類3號(hào)，第七類包括10個(gè)品種，分別為4、5、24、7、21、22、9、18、15、17號(hào)，而該大類在相似系數(shù)0.785處，又分成2個(gè)亞類，第一亞類為4、5和24號(hào)，第二亞類為7、21、22、9、18、15和17號(hào).第八類1、2、11、20、6、8和23號(hào)，該大類在相似系數(shù)0.815處，分為8、23號(hào)和1、2、11、20號(hào)2個(gè)亞類，且1和2的相似性很大.顯然，與24個(gè)品種的形態(tài)性狀聚類分析結(jié)果相比，RAPD數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果更詳細(xì)，其中一致性比較好的是形態(tài)聚類的第Ⅰ類和RAPD的第七類，2個(gè)類中有7個(gè)品種是相同的，分別是5，17、9、18、24、24、15，而形態(tài)聚類的第Ⅱ類的7、22，在RAPD聚類中聚到了第七類中.第Ⅲ類與第八類有3個(gè)是相同的，分別是8、11和23.可見形態(tài)聚類與遺傳分析聚類間有較大的一致性，但后者更為詳細(xì)和準(zhǔn)確.

圖3 24份普通白菜RAPD數(shù)據(jù)聚類圖

3 討論

利用各種分子標(biāo)記，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析來鑒定種間或變種間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，已在不少植物種質(zhì)上得到了廣泛應(yīng)用［24-26］，尤其是變種繁多的不結(jié)球白菜上［3，5-6，10］.雖然在同種或變種的不同品種間的分子鑒定不多，但也取得了一定成功，陳素娟等利用SRAP、RAPD和SSP鑒定了12個(gè)普通白菜的親緣關(guān)系，得到了遺傳距離很近的結(jié)論［27］；杜黎明等利用ISSR技術(shù)鑒定了65個(gè)白菜品種的遺傳多樣性，相似系數(shù)為0.40～0.65［28］.此外，在其他作物如小麥［29］、石榴［30］、菠蘿［13］、荸薺［31］也得到了應(yīng)用.這些成果較好地支持了本研究的結(jié)論.普通白菜是不結(jié)球白菜5個(gè)變種的最大變種，品種繁多，自然變異造成的種質(zhì)關(guān)系非常復(fù)雜；此外，制種單位又多，信息溝通不夠暢通，同名異種、異名同種的現(xiàn)象普遍存在.這些情況不僅使種子真實(shí)性受到質(zhì)疑，也給種質(zhì)收集和保存、種質(zhì)利用和創(chuàng)新，以及種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)帶來困難.

本研究對(duì)24份不同地區(qū)的普通白菜種質(zhì)，在形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上，利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，研究了種質(zhì)間的親緣關(guān)系，雖然樣本群體有限，但其結(jié)果顯示了形態(tài)與分子鑒定在大多數(shù)情況下，鑒定結(jié)果一致，可相互印證提高真實(shí)性；但也存在不一致性，表現(xiàn)為有些種質(zhì)在表型性上相似，形態(tài)學(xué)方法聚為一類，但RAPD分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)關(guān)系較遠(yuǎn)，如20號(hào)與10、16和19號(hào)在形態(tài)聚類中距離較近，而在RAPD聚類中相似系數(shù)則較小，顯示出分子水平上的較大遺傳差異.而有些種質(zhì)在形態(tài)學(xué)上距離較遠(yuǎn)，分屬兩個(gè)大類，但RAPD分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)遺傳背景相近，屬一類，如21、7、22號(hào)種質(zhì).可見，由于RAPD標(biāo)記的是穩(wěn)定的DNA，較之形態(tài)鑒定的結(jié)果更為可靠.前人研究成果也較好地支持了親緣關(guān)系鑒定可采用形態(tài)與分子鑒定相結(jié)合的手段，而分子鑒定更為準(zhǔn)確的結(jié)論［5-6，24-26］.

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Morphological character and RAPD analysis of genetic diversity of different types of Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.) Makino var.communis Tsee et Lee.pakchoi

XIAO He，WANG Meng，CUI Lijie，KAI Guoyin，PAN Jingxian
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

The genetic diversity of 24 accessions of pakchoi(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.)from different districts of China was identified by morphological characters and RAPD analysis.The results showed that the coefficient of variation of 13 morphological characters of materials was from 12.4%to 69.9%，the most was petiole length，and the least cotyledon.24 accessions were clustered into 4 groups at the distance of 5 in morphological cluster.113 bands were detecteded by15 RAPD primers，and 83 were polymorphic.The percentage of polymorphic bands was 73.4%，and the number of average and polymorphic bands each primer were 7.53 and 5.53 respectively.In RAPD analysis，8 groups at the genetic distance of 0.77 were obtained based on RAPD data.There were the overlaps and segmentation between the results of RAPD and morphological cluster.Nei＇s diversity(H)and Shannon information index(I)based on 4 types of morphological analysis were both the order ofⅣ＞Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅱ，and H and I ofⅣwere 0.2395 and 0.3523 respectively.H and I of Jianghui area were the highest in China，being 0.2076 and 0.3098 respectively.These data were in accordance with the diversity characteristics and rejoin distribution of pakchoi germplasms.

Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.communis Tsee et Lee.；Morphological characters；RAPD analysis；Clustering analysis

S 634.3

A

1000-5137(2015)06-0585-08

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.002

(責(zé)任編輯：顧浩然，包震宇)

2015-12-01

潘靜嫻，中國(guó)上海市徐匯區(qū)桂林路100號(hào)，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院，郵編：200234，E-mail：panjingx @shnu.edu.cn