不結(jié)球白菜子葉離體培養(yǎng)與植株再生的研究

卞瑩瑩，顏彬，崔麗潔，潘靜嫻，開國銀

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

不結(jié)球白菜子葉離體培養(yǎng)與植株再生的研究

卞瑩瑩，顏彬，崔麗潔，潘靜嫻，開國銀

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

以不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)“矮萁蘇州青”子葉為外植體，研究了激素濃度和AgNO3濃度組合對不結(jié)球白菜離體培養(yǎng)的影響.結(jié)果表明：誘導(dǎo)不定芽形成的最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA；在此基礎(chǔ)上添加5 mg/L AgNO3可顯著提高不定芽的誘導(dǎo)頻率，芽誘導(dǎo)頻率高達31.3%；生根最佳培養(yǎng)基為含有0.3 mg/L NAA的1/ 2MS培養(yǎng)基.該研究初步建立了“矮萁蘇州青”的植株再生體系，為用基因工程手段開展不結(jié)球白菜分子育種奠定了基礎(chǔ).

不結(jié)球白菜；植株再生；組織培養(yǎng)

0 引言

不結(jié)球白菜屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，又名小白菜、青菜，原產(chǎn)于我國［1］，南北均有分布，特別是南方栽培十分普遍［2］.不結(jié)球白菜是一、二年生草本植物，常作一年生栽培，莖葉均可食.葉色淡綠至墨綠，葉片倒卵形或橢圓形，葉片光滑或褶縮，少數(shù)有絨毛.

小白菜是一種常見的四季時令蔬菜，是我國南方重要的葉類蔬菜.據(jù)測定，小白菜是礦物質(zhì)和維生素含量最豐富的蔬菜之一［3-4］，在蔬菜中占據(jù)重要的地位，深受大眾的青睞［5-7］.小白菜不耐高溫，連續(xù)高溫會使其出現(xiàn)生長緩慢甚至死苗的癥狀，從而導(dǎo)致小白菜品質(zhì)降低及產(chǎn)量下降.因此，培育耐熱的小白菜品種顯得尤為迫切.與傳統(tǒng)育種相比，利用基因工程技術(shù)培育小白菜新種質(zhì)或新品種可能更具有快速和針對性強等優(yōu)點［8］；而建立高效穩(wěn)定的植株再生體系是開展小白菜遺傳轉(zhuǎn)化的前提.與蕓薹屬其他作物相比，小白菜植株再生較難，嚴(yán)重地制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小白菜品種改良中的應(yīng)用.近年來國、內(nèi)外學(xué)者在小白菜離體再生方面進行了一些探索，但高頻率的再生體系報道極少［9］，不同遺傳型對激素種類、濃度和AgNO3要求上存在較大差異.生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的“矮萁蘇州青”等的再生頻率低，從而影響基因轉(zhuǎn)化工作的開展.

本研究以不結(jié)球白菜“矮萁蘇州青”子葉為外植體，通過優(yōu)化培養(yǎng)基中激素6-BA(6-benzylaminopurine，6-芐氨基嘌呤)與NAA(α-naphthaleneacetic acid，萘乙酸)的濃度組合和AgNO3濃度，考察其對小白菜子葉離體培養(yǎng)再生芽的影響，以及生根培養(yǎng)基中激素NAA濃度對不定芽生根的影響，建立一個較高效率的小白菜離體再生體系，為小白菜的基因轉(zhuǎn)化提供了一個理想的轉(zhuǎn)化受體體系，該方法一定程度上有效地解決了小白菜植株再生頻率低等問題.

1 材料與方法

1.1 供試材料

以不結(jié)球白菜品種“矮萁蘇州青”為材料，購自上海長征蔬菜種子公司.

1.2 “矮萁蘇州青”無菌苗和外植體的獲得

挑選籽粒飽滿的成熟“矮萁蘇州青”種子，使用種子常規(guī)滅菌方法消毒滅菌，即先用75%的乙醇溶液表面殺菌約0.5 min，然后用無菌水反復(fù)沖洗2～3次，再用0.1%的HgCl2溶液滅菌10 min，最后用無菌水反復(fù)沖洗4～5次.將滅菌后的種子播種于添加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉的常規(guī)1/2 MS(Murashige and Skoog medium)基本培養(yǎng)基表面，在25℃條件下暗培養(yǎng)2 d，再移至光照條件下生長3 d(光照時間16 h/d，光照強度2000 lx).選取苗齡為5 d的無菌苗子葉，用手術(shù)刀切下帶2～3 mm子葉柄的子葉，但不保留生長點，作為外植體.

1.3 子葉愈傷組織的誘導(dǎo)

將切好的子葉外植體接種到MS基本培養(yǎng)基，放入25℃培養(yǎng)箱暗處理2 d，然后將子葉外植體接種到含有0～6.0 mg/L 6-BA和0～0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基(添加1%的瓊脂、3%的蔗糖)上誘導(dǎo)愈傷組織，滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.5，121℃滅菌25 min.培養(yǎng)條件均為溫度25℃，光照時間16 h/d，光照強度為2000 lx.15 d后觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況，并統(tǒng)計相關(guān)數(shù)據(jù).

1.4 不定芽的誘導(dǎo)

將生長狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)至含不同激素配比的MS分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基添加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，在25℃條件下暗培養(yǎng)2 d，再移至光照條件下生長3 d(光照時間16 h/d，光照強度2000 lx).15 d后更換新鮮培養(yǎng)基，25 d后統(tǒng)計相關(guān)數(shù)據(jù)，觀察不同激素濃度下外植體的芽誘導(dǎo)率，并觀察在培養(yǎng)基中添加AgNO3對芽誘導(dǎo)率的影響.

1.5 不定芽的生根培養(yǎng)

當(dāng)不定芽生長至2～3cm，將不定芽剪下來，插入到含有不同濃度NAA的1/2 MS生根培養(yǎng)基中，滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.5，121℃滅菌25 min.培養(yǎng)條件均為溫度25℃，光照時間16 h/d，光照強度2000 lx.15 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基對不定芽生根的影響情況.

1.6 植株的移栽

待不定芽基部形成大量的根，煉苗3 d后，取出小植株，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到珍珠巖基質(zhì)中，塑料薄膜保濕5 d，逐漸揭膜，8 d后即可入土栽培.

1.7 計算方法

根據(jù)以下公式計算芽誘導(dǎo)頻率，并對結(jié)果進行分析：

芽誘導(dǎo)頻率=(誘導(dǎo)不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù))×100%，愈傷誘導(dǎo)頻率=(愈傷組織塊數(shù)/接種外植體數(shù))×100%.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 激素濃度配比對不定芽分化的影響

將生長狀態(tài)良好并未經(jīng)過繼代的愈傷組織轉(zhuǎn)至含不同激素濃度配比的MS培養(yǎng)基(M0～M15)中，25 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)，觀察不同激素濃度下外植體的不定芽發(fā)生情況(表1).不同激素濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響不同，芽誘導(dǎo)頻率介于0～25%.由表1可知，當(dāng)MS培養(yǎng)基中不添加6-BA和NAA時，不結(jié)球白菜“矮萁蘇州青”的子葉外植體不能形成再生芽，形成的愈傷組織也很少，但能形成細(xì)長的氣生根(圖1-0)，而當(dāng)加入6-BA和NAA時，2周后就形成愈傷組織.2周后繼代培養(yǎng)基，放置1周后，愈傷組織處出現(xiàn)綠色的芽點.研究結(jié)果表明：在同時添加6-BA和NAA時，子葉能形成愈傷組織且具有分化不定芽的能力；6-BA濃度越高，芽的分化能力就越強；但當(dāng)6-BA的濃度達到6.0 mg/L時，芽的分化能力開始降低；3種不同濃度的NAA對于愈傷組織的形成和芽的誘導(dǎo)沒有明顯的規(guī)律(圖1).在本實驗中，最佳培養(yǎng)基編號為11，即含有0.3 mg/L NAA和5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基，最高芽誘導(dǎo)頻率為23.0%.

表1 不同激素濃度配比對小白菜不定芽分化的影響

圖1 添加不同濃度激素的培養(yǎng)基對小白菜不定芽的影響

2.2 NAA對不定芽生根的影響

將不定芽生成的再生苗轉(zhuǎn)入含不同濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng).15 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基對不定芽生根的影響情況.結(jié)果顯示：不定芽在15 d后都可以生根，在不添加NAA的1/2 MS培養(yǎng)基時，不定芽也能生根，生根率都達到100%，而添加了NAA的培養(yǎng)基會改變根的形態(tài)(表2)，當(dāng)NAA濃度為0.3 mg/L時，主根多而壯，須根少，健康茁壯的根對苗的移栽是至關(guān)重要的，因此添加0.3 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基最適合不定芽的生根，有利于移栽.

表2 激素對小白菜生根培養(yǎng)的影響

2.3 AgNO3濃度對芽誘導(dǎo)的影響

通過不同濃度配比的激素對子葉外植體進行芽誘導(dǎo)能力的對比，在選擇最適激素濃度配比的基礎(chǔ)上，在激素培養(yǎng)基中加入不同濃度(1、3、5、7 mg/L)的AgNO3［10-12］，接種48個子葉外植體，觀察記錄芽的誘導(dǎo)頻率變化.結(jié)果表明：在選擇最適激素濃度配比的基礎(chǔ)上，再添加5 mg/L AgNO3可使芽誘導(dǎo)頻率高達31.3%，即誘導(dǎo)不定芽形成的最適培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L NAA+5mg/L 6-BA+5 mg/L AgNO3(表3).在AgNO3濃度達到7 mg/L時，對芽的誘導(dǎo)反而起到了抑制作用.

表3 AgNO3濃度對小白菜芽誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論

不結(jié)球白菜與其他蕓薹屬作物相比再生頻率較低［12-13］.本文作者初步研究了以不結(jié)球白菜“矮萁蘇州青”子葉為外植體的不定芽誘導(dǎo)和植株再生的培養(yǎng)方法，為進一步的遺傳操作奠定了基礎(chǔ).激素是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)激素水平和配比已成為提高組織分化頻率的有效手段［14-15］.通過將“矮萁蘇州青”子葉接種到附加不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷再分化不定芽，待不定芽生長到一定程度再將其轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中，生根后移栽.結(jié)果表明：誘導(dǎo)不定芽形成的最佳培養(yǎng)基為MS +0.3 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA；在此基礎(chǔ)上添加5 mg/L AgNO3可顯著提高不定芽的誘導(dǎo)頻率，該培養(yǎng)基可使“矮萁蘇州青”的芽誘導(dǎo)頻率高達31.3%；生根最佳培養(yǎng)基為含有0.3 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基.

植物的子葉、子葉柄、下胚軸、莖段等經(jīng)常被用于植株再生［16］，其中子葉是小白菜離體再生中使用最多的外植體［17］.帶柄子葉與單純子葉塊、子葉柄或真葉相比又具有較高的植株再生能力［18-19］，本研究采用帶柄子葉作為外植體，獲得了較高的植株再生頻率［20］，表明了帶柄子葉是小白菜離體培養(yǎng)的適合外植體.

前人報道，AgNO3能促進植株再生［10，21-22］，本實驗的研究結(jié)果也與該結(jié)論一致，但當(dāng)AgNO3濃度達到7 mg/L時，反而抑制了不定芽的誘導(dǎo).張金文等［24］在辣椒離體培養(yǎng)中也有類似報道，這可能是由于Ag+是重金屬離子，濃度太高反而會對植物產(chǎn)生有害作用.

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Study on plantlet regeneration and in vitro culture of non-heading Chinese cabbage

BIAN Yingying，YAN Bin，CUI Lijie，PAN Jingxian，KAI Guoyin
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

The cotyledon of non-heading Chinese cabbage(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)was used as explants to investigate the effects of different concentrations of hormone and of AgNO3on its culturein vitrobased on one variety″short broom suzhouqing″.The results showed that the induction rate of adventitious bud was the highest on the MS medium containing 0.3 mg/L NAA and 5 mg/L 6-BA，while 5 mg/L AgNO3added on this medium could efficiently improve the regeneration rate (high to 31.3%).Meanwhile，half strength MS supplemented with 0.3 mg/L NAA was the best medium for rooting of non-heading Chinese cabbage.Our study set up a primary regeneration system for non-heading Chinese cabbage short broom suzhouqing.This system laid the foundation of molecular breeding of non-heading Chinese cabbage using genetic engineering further.

Brassica campestris ssp.chinensis Makino；plantlet regeneration；tissue culture

S 5-33

A

1000-5137(2015)06-0579-06

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.001

(責(zé)任編輯：顧浩然，郁慧)

2015-10-01

卞瑩瑩，中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，郵編：200234，E-mail：bian _118@163.com；開國銀，中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，郵編：200234，E-mail：gykai@shnu.edu.cn