丁香葉提取物對(duì)豬源性大腸桿菌的抑菌作用研究

■王 潔 王冬梅 齊富剛 劉明生 陳 明

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

丁香種植廣泛，取材方便，其葉中不同的化學(xué)成分有抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種作用。炎立消膠囊、片劑的研制開(kāi)發(fā)及臨床療效良好。黃酮是存在于植物體內(nèi)一大類物質(zhì)，能夠有效清除體內(nèi)的自由基及毒素，預(yù)防、減少疾病的發(fā)生，還具有消炎、抗過(guò)敏、廣譜抗菌、抗病毒作用[1-2]。本研究以干燥丁香葉為材料，利用乙醇作為提取劑，采用超聲輔助方法提取黃酮，探討了丁香葉黃酮對(duì)兩種不同血清型的大腸桿菌的抑制效果，為丁香葉提取物防治仔豬腹瀉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丁香葉

采集自泰州市園博園，將丁香葉先用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水洗2遍，用濾紙或紗布吸干水，于90℃殺酶15 min，在60～65℃烘干至脆，粉碎，過(guò)篩，備用。

1.2 供試菌株

豬源性大腸桿菌K1、K2，由揚(yáng)州動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物教研室贈(zèng)予。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平（萬(wàn)分之一）（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）；TD5M大容量低速離心機(jī)（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-1800紫外分光光度儀（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Fw135中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；YXQLS-50SH立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；101-3電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司）；120622-07896孔板（BIOFIL）。

1.4 菌種的活化及傳代培養(yǎng)

配制200 ml的普通肉湯液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆?。取?20℃下甘油保存的大腸桿菌菌種K1和K2，分別蘸取菌液接種至兩個(gè)加入5 ml肉湯液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，空白對(duì)照管只加入5 ml肉湯液體培養(yǎng)基，標(biāo)記接種的菌種和日期后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

以相同接種方法對(duì)大腸桿菌菌種K1和K2進(jìn)行傳代純化培養(yǎng)幾代后，即可備用。

1.5 丁香葉總黃酮提取液前處理

先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下，減壓濃縮，將丁香葉提取液蒸發(fā)到少于15 ml，再放入減壓烘干箱中烘干，備用；精確稱取0.2 g丁香葉提取物，充分溶于1 ml去離子水中，配制成濃度為0.2 g/ml的丁香葉提取備用液，依次使用0.45 μm微孔濾膜、0.22 μm微孔濾膜對(duì)備用液進(jìn)行過(guò)濾渣滓和除菌，置于4℃冰箱中進(jìn)行短期保存；配制濃度為0.8 g/ml的丁香葉提取備用液，配制和儲(chǔ)存方法同上。無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水將藥液稀釋成8 000 μg/ml，備用。

1.6 抑菌圈直徑的測(cè)定

在無(wú)菌操作下，取傳代培養(yǎng)的大腸桿菌菌液用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛却_定為1.0×108CFU/ml；取2 ml菌液，加入普通固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，用三角玻璃棒刮勻，采用平板打孔法制作藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基。

用無(wú)菌移液器分別吸取0.2 g/ml和0.8 g/ml的丁香葉提取液20 μl，加到培養(yǎng)皿的不同孔中，對(duì)照孔中加20 μl的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液；然后，將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)。

判定藥物對(duì)細(xì)菌抑制作用的標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑高于15 mm，細(xì)菌對(duì)藥物高度敏感；抑菌圈在10～15 mm，細(xì)菌對(duì)藥物中度敏感；抑菌圈小于10 mm，細(xì)菌對(duì)藥物低度敏感；無(wú)抑菌圈，細(xì)菌對(duì)藥物不敏感。

1.7 最低抑菌濃度的測(cè)定

將傳代復(fù)壯的大腸桿菌用0.9%生理鹽水稀釋，用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛却_定為1.0×108CFU/ml，再將菌液稀釋1 000倍，最終菌液濃度為1.0×105CFU/ml，備用。

在無(wú)菌條件下，取96孔板，第一行的第1～10孔中，每孔均加入200 μl大腸桿菌K1稀釋液；在第1孔中加入200 μl濃度為8 000 μg/ml丁香葉總黃酮提取液，采用微量倍比稀釋法，依次稀釋直至第10孔，第11孔加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為對(duì)照孔，1～11孔分別相當(dāng)于總黃酮濃度為4 000、2 000、1 000、500、250、125、64.5、32.25、16.125、8.06 μg/ml。

為了通過(guò)肉眼明確判斷試驗(yàn)結(jié)果，第二行和第四行的第1～6孔均加入200 μl大腸桿菌K1稀釋液。

第五行和第七行從第1孔至第10孔中每孔均加入200 μl大腸桿菌K2稀釋液，操作方法同大腸桿菌K1。第六行和第八行第1～6孔均加入200 μl大腸桿菌K2稀釋液。將96孔板蓋好，用封口膜封好，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 抑菌圈直徑結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 抑菌圈結(jié)果

2.2 丁香葉中總黃酮對(duì)豬源性大腸桿菌的最低抑菌濃度結(jié)果

丁香葉中總黃酮對(duì)豬源性大腸桿菌的最低抑菌濃度的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可判斷，0.8 g/ml的丁香葉總黃酮提取備用液對(duì)豬源性大腸桿菌K1和K2的最低抑菌濃度為1 000 μg/ml。

表2 96孔板加藥濃度及MIC結(jié)果

3 討論

3.1 平板打孔法抑菌試驗(yàn)結(jié)果的分析

李熊利[3]通過(guò)濾紙片法研究霍山蹦蝗黃酮對(duì)大腸桿菌的抑菌作用，其抑菌圈直徑為(18.08±0.75)mm，說(shuō)明黃酮提取物對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用。林志欽[4]用杯碟法研究了蓮子心總黃酮提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，所得抑菌圈直徑為(18.4±0.5)mm。常麗新等[5]通過(guò)使用濃度為942.21 μg/ml的丁香葉黃酮提取液用量分別為2、3 ml和4 ml，對(duì)大腸桿菌均有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)所得結(jié)果說(shuō)明，丁香葉提取液濃度為0.2 g/ml時(shí)對(duì)豬體內(nèi)采集的大腸桿菌K1的抑菌圈直徑為10 mm，對(duì)豬體內(nèi)采集的大腸桿菌K2的抑菌圈直徑為13 mm，為中度敏感；濃度為0.8 g/ml的丁香葉提取液對(duì)豬體內(nèi)采集的大腸桿菌K1的抑菌圈直徑為20 mm，對(duì)豬體內(nèi)采集的大腸桿菌K2的抑菌圈直徑為21 mm，為高度敏感。因此，從豬體內(nèi)采集的大腸桿菌對(duì)丁香葉提取物高度敏感，而且隨著提取物濃度的增加，抑菌效果更佳。

3.2 最低抑菌濃度結(jié)果的分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，丁香葉提取物對(duì)從豬體內(nèi)采集的大腸桿菌K1和K2的最低抑菌濃度為1 000 μg/ml。常麗新等[5]通過(guò)微波提取法對(duì)丁香葉總黃酮進(jìn)行提取后，對(duì)大腸桿菌的MIC值為942.21 μg/ml，說(shuō)明丁香葉總黃酮對(duì)傳統(tǒng)的大腸桿菌有一定的抑制作用，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本吻合。

因此，豬體內(nèi)采集的大腸桿菌對(duì)丁香葉提取物較敏感，丁香葉提取物濃度為0.8 g/ml時(shí)對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制效果，最低抑菌濃度為1 000 μg/ml。