沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃內(nèi)環(huán)境（體外）的影響

■包玲玲 敖長金 薩茹麗 王 園 王翠芳 王思珍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

沙蔥作為蔥屬植物，主要分布在我國內(nèi)蒙古自治區(qū)中西部及西北等地區(qū)的荒漠化草原上，是一種資源豐富的植物，也是放牧綿羊喜愛采食的牧草。劉麗娟等[1]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物是蔥屬植物的主要活性成分之一，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。由于蔥屬植物中已知的黃酮類化合物均含有酚羥基結(jié)構(gòu)，因此是較好的抗氧化劑。盧媛等[2]研究指出，舍飼肉羊飼料中添加采食沙蔥凍干粉可以顯著降低肉羊的發(fā)病率，提高生長速度，改善羊肉風(fēng)味，并且顯著提高體外培養(yǎng)液中干物質(zhì)降解率、揮發(fā)性脂肪酸濃度和產(chǎn)氣量。張巧娥在精粗比為30∶70日糧條件下，通過添加沙蔥水溶性提取物和沙蔥脂溶性提取物研究了對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，沙蔥水溶性提取物和脂溶性提取物均能改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，促進瘤胃發(fā)酵[3]。本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步研究沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響，以期篩選綿羊日糧中沙蔥黃酮類化合物的適宜添加量，為沙蔥及其深加工產(chǎn)品在肉羊養(yǎng)殖中的進一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 沙蔥采集

采自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市鄂托克前旗天然草場，依據(jù)薩茹麗（2014）報道方法提取沙蔥黃酮類化合物[4]。

1.1.2 試驗動物飼養(yǎng)管理與日糧配方

選取4只健康、平均體重為(34.6±1.5)kg的蒙古羯羊，通過手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管，用于采集瘤胃液。試驗日糧按代謝能維持需要1.2倍的營養(yǎng)水平配制。試驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。日糧配方精粗比為30∶70，試驗日糧的飼喂總量按照試驗羊體重的2%（450 g），每天8:00和18:00分兩次等量飼喂。試驗羊于試驗前驅(qū)蟲，單籠飼養(yǎng)，自由飲水。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平

1.1.3 試驗儀器

酶標儀(Biotek Synergy H4)、氣相色譜儀(惠普5890-Ⅱ型)、恒溫水浴鍋(HZH-S)、低溫高速離心機(GL-21型)、PHS-3B型酸度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

沙蔥黃酮類化合物的添加量根據(jù)張巧娥[3]試驗結(jié)果得出的水溶性、脂溶性提取物的最佳添加水平分別為335 mg/kg日糧、20 mg/kg日糧來確定。在各發(fā)酵瓶中裝入2 g培養(yǎng)底物，分別添加培養(yǎng)液30 ml、瘤胃液15 ml、不同比例（0.000、0.022、0.032、0.042、0.052 mg）沙蔥黃酮類化合物，混合均勻后放置39℃恒溫水浴搖床上進行24 h培養(yǎng)。預(yù)設(shè)4、9、14、19、24 h，5個采樣時間點，各組在每個預(yù)設(shè)采樣時間點均設(shè)3個重復(fù)。緩沖液的配制參照霍鮮鮮(2003)[5]。

常量元素藥劑：準確稱取KH2PO4292 mg、NaCl 200 mg、MgSO4· 7H2O 100 mg、（NH4）2SO4480 mg、Na2CO34 000 mg、K2HPO4·3H2O 382.51 mg用蒸餾水定容至1 000 ml。

微量元素藥劑：準確稱取Na2EDTA 500 mg、Mn?Cl2·4H2O 200 mg、FeSO4·7H2O 200 mg、CoCl2·6H2O 20 mg、CuCl2·2H2O 1.0 mg、NaMoO43.0 mg、NiCl2·6H2O 2.0 mg、ZnSO4·7H2O 10 mg、H3BO330 mg，用蒸餾水定容至1 000 ml。

還原液藥劑：準確稱取Na2S·9H2O 25 g用蒸餾水定容至100 ml。

1.2.2 樣品采集

發(fā)酵至4、9、14、19、24 h時，記錄體外產(chǎn)氣量，收集各時間點各處理組培養(yǎng)液，立即測定pH值后，用四層紗布過濾，收集濾液，去除殘渣，收集的濾液4 000 r/min離心10 min，用移液槍吸出0.5 ml上清液，置于預(yù)先裝好4.5 ml 0.2 M HCl的10 ml離心管中，并用手搖勻放入-20℃冰箱，待測氨態(tài)氮(NH3-N)濃度；再用5 ml的移液槍吸取4 ml上清液，移入預(yù)先裝有1 ml 25%的偏磷酸（HPO3）和蟻酸（CH2O2）混合液（3∶1）的10 ml離心管中，冷藏-20℃冰箱，用來待測揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度；剩余的上清液緩慢吸入20 ml離心管中，-20℃保存，用來測定菌體蛋白（BCP）濃度；采樣的過程中，每次樣品采集結(jié)束后，該時間點的培養(yǎng)瓶棄用。

1.2.3 測定指標及方法

1.2.3.1 產(chǎn)氣量的測定

分別在4、9、14、19 h和24 h記錄每個樣品產(chǎn)氣量，氣體收集裝置為醫(yī)用注射器，最大容積為30 ml。

1.2.3.2 pH值的測定

培養(yǎng)4、9、14、19 h和24 h后，立即用pHS-3B酸度計測定濾液pH值。

1.2.3.3 瘤胃液氨氮（NH3-N）濃度的測定

瘤胃液中氨態(tài)氮的測定方法參照馮宗慈等的方法進行[6]。培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)瓶，4層紗布過濾，濾液移至10 ml離心管，4 000 r/min離心15 min，去除原蟲和飼料殘余顆粒。使用苯酚-次氯酸鈉比色法測定上清液中NH3-N含量。

1.2.3.4 菌體蛋白（BCP）測定

菌體蛋白測定參照Cone等闡述方法[7]。培養(yǎng)結(jié)束后，樣品前處理同NH3-N含量測定。采用考馬斯亮藍法測定上清液中菌體蛋白含量。

1.2.3.5 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定

用日本島津GC-7A氣相色譜儀(惠普5890-Ⅱ型)法進行測定培養(yǎng)液中揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的濃度。

1.3 統(tǒng)計分析

本試驗數(shù)據(jù)初步用EXCEL整理后，統(tǒng)計采用SAS 8.0版軟件中單因素方差分析（ANOVA）進行，差異顯著時采用Duncan's法進行多重比較。當(dāng)P＜0.05時，表示差異顯著。

2 結(jié)果

表2 沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃微生物體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響（ml）

如表2所示，各處理組間在整個培養(yǎng)期內(nèi)產(chǎn)氣量變化趨勢一致，均呈現(xiàn)上升趨勢。與對照組相比，沙蔥黃酮類化合物添加組各培養(yǎng)時間點的產(chǎn)氣量均極顯著提高（P＜0.01），其中0.032 mg沙蔥黃酮類化合物添加組瘤胃產(chǎn)氣量為最高；0.022、0.042、0.052 mg沙蔥黃酮類化合物添加組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃微生物體外發(fā)酵pH值的影響

如表3所示，整個培養(yǎng)期內(nèi)瘤胃pH值有下降的趨勢，培養(yǎng)4～14 h時，與對照組相比，沙蔥黃酮類化合物組并不顯著影響體外發(fā)酵pH值；19～24 h時，0.032、0.042 mg沙蔥黃酮類化合物添加組pH值極顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.01）。

由表4結(jié)果可以看出，在整個培養(yǎng)期內(nèi)添加沙蔥黃酮類化合物組與對照組的NH3-N濃度變化趨勢一致。整個體外培養(yǎng)期內(nèi)，4、14、19 h時0.032 mg和0.042 mg沙蔥黃酮類化合物添加組NH3-N濃度極顯著低于對照組和其他試驗組（P＜0.01）；9、24 h時0.032 mg和0.042 mg沙蔥黃酮類化合物添加組NH3-N濃度顯著低于對照組和其他試驗組（P＜0.05）。

由表5果可以看出，在整個培養(yǎng)期內(nèi)（4～24 h），0.042 mg沙蔥黃酮類化合物添加組培養(yǎng)液中BCP濃度極顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.01）。

由表6結(jié)果可以看出，整個培養(yǎng)期內(nèi)各組的VFA濃度逐漸上升的趨勢。整個培養(yǎng)期內(nèi)，0.022、0.032、0.042 mg沙蔥黃酮類化合物添加組的VFA濃度極顯著高于對照組（P＜0.01），其中0.042 mg添加組最高，0.032 mg添加組次之。0.052 mg沙蔥黃酮類化合物添加組的VFA濃度極顯著低于對照組和其他試驗組（P＜0.01）。

表4 沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃微生物體外發(fā)酵氨態(tài)氮濃度的影響（mg/100 ml）

表5 沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃微生物體外發(fā)酵菌體蛋白濃度的影響(mg/100 ml)

表6 沙蔥黃酮類化合物對綿羊瘤胃微生物體外發(fā)酵VFA的影響(mM/l)

3 討論

體外批次培養(yǎng)法是一種用來評價反芻動物飼草料營養(yǎng)價值的經(jīng)典方法，得到了發(fā)達國家的普遍采用。這種方法具有較好地模擬反芻動物瘤胃發(fā)酵過程和較準確預(yù)測體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消化率的優(yōu)點。當(dāng)然對于靜態(tài)的瘤胃液培養(yǎng)，它也存在許多的問題，即它脫離了活體內(nèi)瘤胃壁對發(fā)酵產(chǎn)物的吸收和瘤胃壁向瘤胃內(nèi)分泌某些活性物質(zhì)。

產(chǎn)氣量是反映反芻動物瘤胃發(fā)酵水平高低的直接標志。瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量與飼料底物在瘤胃中的發(fā)酵水平呈正相關(guān)，產(chǎn)氣量越大，瘤胃發(fā)酵水平越高[8]。盧媛（2002）[2]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂沙蔥凍干粉可以提高體外發(fā)酵產(chǎn)氣量，本試驗也同樣得出，添加不同濃度的沙蔥黃酮類化合物后，也顯著提高瘤胃產(chǎn)氣量，并且在沙蔥黃酮類化合物添加量為0.032 mg時達到最大。

瘤胃pH值的波動直接反映瘤胃發(fā)酵的變化以及微生物的活動。當(dāng)反芻動物采食日糧后，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在瘤胃內(nèi)迅速發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸導(dǎo)致瘤胃pH值下降。瘤胃的pH值比較穩(wěn)定，通常在5.5～7.5之間變化。已知pH值為6.2～6.8時，瘤胃微生物發(fā)酵纖維物質(zhì)的活性最高；pH值為5.5～6.0時，瘤胃微生物發(fā)酵淀粉的活性最強；當(dāng)瘤胃pH值降低到5.5以下時，原蟲的生長就會受阻，動物出現(xiàn)酸中毒[9]。趙春艷[10]研究報道，飼喂沙蔥組的肉羊瘤胃內(nèi)環(huán)境中BCP、VFA及pH值顯著高于對照組，而NH3-N的濃度顯著降低。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加沙蔥黃酮類化合物顯著提高培養(yǎng)后期的瘤胃pH值，并且pH值均在正常范圍之內(nèi)，以0.032 mg和0.042 mg添加組對pH值的影響較大，這說明沙蔥黃酮類化合物能夠有效促進瘤胃pH值。

瘤胃內(nèi)氨的最主要去路是瘤胃微生物的攝取，NH3-N是纖維素分解菌的必需氮源，也是非纖維素分解菌的部分氮源。因此NH3-N濃度綜合反映了瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3-N的速度及其對NH3-N的攝取利用情況，是直接反映瘤胃微生物活力的重要指標，也是影響微生物蛋白合成效率的重要因素[11]。瘤胃液中微生物生長最佳NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/100 ml[12]。研究表明，體外培養(yǎng)條件下，瘤胃微生物生長的最佳NH3-N濃度為5～8 mg/100 ml，體內(nèi)條件下為：7～9 mg/100 ml[13]。本研究結(jié)果表明，添加0.032 mg和0.042 mg沙蔥黃酮類化合物顯著降低培養(yǎng)液中NH3-N濃度，并NH3-N濃度均處于最佳范圍之內(nèi)，可能是日糧中添加沙蔥黃酮類化合物，使得瘤胃中可降解蛋白減少，導(dǎo)致NH3-N濃度降低。也有可能是沙蔥黃酮類化合物刺激瘤胃微生物菌群攝取NH3-N并合成蛋白質(zhì)引起的。

微生物菌體蛋白是反芻動物最主要的氮源供應(yīng)者，能夠提供其蛋白需要的40%～80%。微生物生長最主要的營養(yǎng)物質(zhì)是蛋白質(zhì)和碳水化合物，并需要包括維生素、常量元素和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)的輔助，會受到反芻動物瘤胃pH值和NH3-N濃度的直接影響。BCP濃度可以間接反映培養(yǎng)體系中微生物種群的數(shù)量以及微生物利用NH3-N的能力。趙國芬[14]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊日糧中添加4%鮮沙蔥，可顯著提高瘤胃BCP濃度。從本試驗結(jié)果看，日糧中添加小劑量（0.042 mg/2 g）的沙蔥黃酮類化合物同樣可以提高培養(yǎng)液中的BCP濃度，這說明沙蔥黃酮類化合物能夠有效促進瘤胃微生物的增殖。

VFA是飼料碳水化合物消化代謝的最終產(chǎn)物，也是綿羊最主要的能量來源，主要參與瘤胃微生物的合成提供能量。其中乙酸、丙酸、丁酸是VFA的主要成分，它們的濃度大小直接反映發(fā)酵類型和吸收情況。研究表明，瘤胃內(nèi)發(fā)酵所產(chǎn)生的VFA可為反芻動物機體提供70%～80%所需能量[15]。本試驗結(jié)果顯示，沙蔥黃酮類化合物顯著提高瘤胃VFA濃度（0.052 mg/2 g除外）。

添加沙蔥黃酮類化合物使體外發(fā)酵產(chǎn)氣量、pH值升高。降低瘤胃NH3-N濃度，增加瘤胃的BCP濃度，有利用于反芻動物的微生物氮的增加，減少反芻動物對蛋白質(zhì)的維持需要；從總體上看來，沙蔥黃酮類化合物能夠促進瘤胃發(fā)酵，優(yōu)化瘤胃內(nèi)環(huán)境。

4 結(jié)論

在體外精粗比為30∶70日糧條件下，與對照組相比，0.032 mg沙蔥黃酮類化合物添加組顯著提高綿羊瘤胃產(chǎn)氣量、pH值(19～24 h)、VFA濃度，顯著降低NH3-N濃度；0.042 mg沙蔥黃酮類化合物添加組顯著提高綿羊瘤胃pH值(19～24 h)、BCP濃度，顯著降低NH3-N濃度。綜合影響瘤胃發(fā)酵水平來推測沙蔥黃酮類化合物在日糧中最適的添加范圍為0.032～0.042 mg/2 g，即16～21 mg/kg。