MTA和BioAggregate對(duì)牙髓細(xì)胞體外覆蓋創(chuàng)面能力的影響

李玲 梅麗琴 李駿

MTA和BioAggregate對(duì)牙髓細(xì)胞體外覆蓋創(chuàng)面能力的影響

李玲 梅麗琴 李駿

目的鉬利用細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型探討無機(jī)三氧化礦物聚合體（MTA）和BioAggregate（BA）對(duì)牙髓細(xì)胞增殖及覆蓋創(chuàng)面能力的影響，并評(píng)價(jià)其生物相容性。 方法 在培養(yǎng)皿中形成牙髓細(xì)胞的融合培養(yǎng)物，去除寬3mm的細(xì)胞層條帶，建立體外創(chuàng)傷模型。在培養(yǎng)皿中分別加入不同濃度的MTA和BA浸提液培養(yǎng)24h，分別為MTA組（MTA原液組、MTA1/2液組、MTA1/4液組，各9皿）和BA組（BA原液組、BA1/2液組、BA1/4液組，各9皿）；以模型中加入含有10%FBS的培養(yǎng)液作為對(duì)照組（9皿）；檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力及遷徙覆蓋能力。 結(jié)果 BA原液組較其他組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，MTA原液組、MTA1/2液組、BA原液組及BA1/2液組細(xì)胞遷徙覆蓋能力均增強(qiáng)（均P＜0.05）；BA原液組細(xì)胞增殖能力及遷徙覆蓋能力均優(yōu)于MTA原液組（均P＜0.05）。 結(jié)論MTA和BA均具有良好的生物相容性，但BA要優(yōu)于MTA。

牙髓 無機(jī)三氧化礦物聚合體 BioAggregate 創(chuàng)傷模型 生物相容性

活髓切斷術(shù)是切除炎性牙髓組織并以蓋髓劑覆蓋于牙髓斷面，保留正常牙髓組織的方法。蓋髓材料需長期存留于體內(nèi)，因此其生物相容性備受關(guān)注。無機(jī)三氧化礦物聚合體（MTA）和BioAggregate（BA）是近年來用于活髓切斷術(shù)后蓋髓的新型生物活性材料。本研究擬采用體外創(chuàng)傷模型模擬直接活髓切斷術(shù)后的創(chuàng)傷環(huán)境，評(píng)價(jià)MTA和BA在此模型中對(duì)牙髓細(xì)胞增殖及創(chuàng)面覆蓋能力的影響，從而比較兩者的生物相容性，為活髓切斷術(shù)后蓋髓材料的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 MTA（美國登士柏公司），BA（加拿大Innovative BioCeramix公司），DMEM、胎牛血清（美國Gibco公司），BrdU（上海吉美生物有限公司），人抗BrdU單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選擇14～29歲患者因正畸需要新鮮拔除的無齲病、牙髓病的健康前磨牙6顆，刮除表面牙周組織，PBS及100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素（雙抗）清洗牙齒表面，無菌條件下將牙齒劈開，挑取牙根中上1/3牙髓，無菌刀切碎，PBS反復(fù)清洗，采用酶消化法消化。將牙髓細(xì)胞在含有20%FBS及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳孵箱內(nèi)，原代細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化，按1︰4傳代培養(yǎng)，傳至第5～8代，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 浸提液配制 每克MTA、BA中分別加入5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育72h。取出各材料浸提液，0.22μm濾膜抽濾除菌，得到原液，并各稀釋成1/2液、1/4液備用。

1.2.3 建立體外創(chuàng)傷模型 牙髓細(xì)胞以每皿5×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種到面積為35mm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，共63皿，培養(yǎng)至細(xì)胞形成單層融合。將含10%FBS的培養(yǎng)液更換成含0.1%FBS的培養(yǎng)液，孵育24h，使絕大部分細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化至G0期。去除培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮子刮除培養(yǎng)皿正中寬3mm的細(xì)胞層，并在劃痕邊緣刻上標(biāo)志線，見圖1。以PBS沖洗3遍，防止細(xì)胞殘留。實(shí)驗(yàn)分為MTA組、BA組和對(duì)照組；MTA組將培養(yǎng)液更換為MTA原液（MTA原液組，9皿）、1/2液（MTA1/2液組，9皿）和1/4液（MTA1/4液組，9皿）繼續(xù)培養(yǎng)24h；BA組原理同上，分為BA原液組、BA1/2液組、BA1/4液組，各組9皿；對(duì)照組培養(yǎng)液為10%FBS，亦9皿。

1.2.4 BrdU標(biāo)記 各組細(xì)胞在終止培養(yǎng)前加入BrdU液（10μmol/L），37℃孵育1h。終止培養(yǎng)，95%乙醇固定、3%H2O2封閉、2mol/L HCl變性及山羊血清封閉后，各組取6皿加人抗BrdU單克隆抗體（1∶100）于4℃、濕盒過夜，同時(shí)各組另3皿以PBS代替人抗BrdU單克隆抗體作為陰性對(duì)照。按說明進(jìn)行SP法染色，DAB顯色，蘇木素襯染，甘油緩沖液封片。BrdU陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈棕褐色顆粒著色、濃染、呈顆粒狀，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞質(zhì)豐富，核質(zhì)比例增大。

圖1 細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型示意圖（白色部分代表被刮除的寬3mm的創(chuàng)傷區(qū)；陰影部分代表創(chuàng)傷后剩余的完整細(xì)胞層；中間的小方框代表觀察區(qū)；黑色箭頭代表觀察區(qū)可緊鄰劃痕內(nèi)側(cè)上下移動(dòng)）

1.2.5 圖像分析 各組6皿BrdU標(biāo)記細(xì)胞，每皿在緊鄰左右劃痕內(nèi)側(cè)分別取3個(gè)視野，即6個(gè)視野，以圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）對(duì)每個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)、BrdU陽性細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面區(qū)面積分別進(jìn)行分析，取平均數(shù)；以細(xì)胞BrdU陽性率代表細(xì)胞增殖能力的定量結(jié)果，以細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率代表細(xì)胞遷徙覆蓋能力的定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTA、BA組牙髓細(xì)胞BrdU標(biāo)記情況 見圖2。

圖2 MTA、BA組牙髓細(xì)胞標(biāo)記情況（a：MTA原液組；b：MTA1/2液組；c：MTA1/4液組；d：BA原液組；e：BA1/2液組；f：BA1/4液組；SP法染色，×400）

由圖2可見，MTA、BA組BrdU陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈棕褐色顆粒著色、濃染，細(xì)胞質(zhì)豐富，核質(zhì)比例增大。

2.2 各組牙髓細(xì)胞BrdU陽性率比較 見表1。

表1 各組牙髓細(xì)胞BrdU陽性率比較（%）

由表1可見，各組牙髓細(xì)胞BrdU陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.29，P＜0.05）；BA原液組與各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），其余各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.3 各組牙髓細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率比較 見表2。

表2 各組牙髓細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率比較（%）

由表2可見，各組牙髓細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=135.65，P＜0.05）；MTA原液組、MTA1/2液組、BA原液組及BA1/2液組牙髓細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率均高于對(duì)照組（均P＜0.05）；MTA1/4液組、BA1/4液組細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率則與對(duì)照組相似（均P＞0.05）；BA原液組較MTA原液組細(xì)胞創(chuàng)面覆蓋率高（P＜0.05）。

3 討論

活髓切斷術(shù)是由Witzel在1872年首創(chuàng)的一種保存活髓的方法，可使牙齒保存活髓的生長和分化能力，促進(jìn)年輕恒牙牙根繼續(xù)發(fā)育，療程可一次完成[1]。在活髓切斷術(shù)中，蓋髓劑起著關(guān)鍵性的作用。理想的蓋髓劑需具有良好的生物相容性、一定的抗菌作用、良好的封閉性能，能成功地隔絕外界刺激，提供牙髓修復(fù)的微環(huán)境，能激發(fā)誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞的分化，形成牙本質(zhì)橋，而且對(duì)牙髓組織無刺激或刺激性小。

細(xì)胞毒性研究是體外評(píng)價(jià)生物材料生物相容性的一種方法。目前已有多種細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法被應(yīng)用于牙科材料的毒性評(píng)定，但所得結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)往往存在差別，主要原因可能是對(duì)活體狀態(tài)的模擬不足。本研究采用了細(xì)胞體外創(chuàng)傷模型綜合評(píng)價(jià)牙髓細(xì)胞的增殖和向創(chuàng)面遷徙覆蓋的能力，能更大程度地模擬和反映實(shí)際愈合情況，從而更好的評(píng)價(jià)蓋髓材料的生物相容性。

有研究表明當(dāng)用細(xì)胞刮子刮除融合細(xì)胞層中的部分細(xì)胞時(shí)，會(huì)同時(shí)去除該部分的細(xì)胞外間質(zhì)成份[2]。這種對(duì)細(xì)胞層進(jìn)行干擾使其“受損”的行為，使得剩余的細(xì)胞比普通培養(yǎng)的細(xì)胞能更敏感地檢測(cè)出各種環(huán)境刺激因素間的不同。在牙科活髓切斷術(shù)后，牙髓組織也受到了一定程度的創(chuàng)傷，牙髓細(xì)胞的增殖和遷徙覆蓋是活髓切斷術(shù)后早期修復(fù)的關(guān)鍵。BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，是最有希望取代同位素的非放射性標(biāo)記物之一。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期（S期）時(shí)，BrdU像胸腺嘧啶核苷一樣滲入合成的DNA中長期存留，作為反映細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)確切可靠。在本研究中細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面能力的大小是以細(xì)胞覆蓋采圖區(qū)面積的百分比來表示，而增殖能力則以BrdU陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比來表示。實(shí)際上細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面能力包括了細(xì)胞遷徙能力和增殖能力，因此在本研究中細(xì)胞遷徙能力只能得到間接的反映。

本研究結(jié)果顯示，MTA組的細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組相似，但在MTA原液組和MTA1/2液組均有細(xì)胞覆蓋能力增強(qiáng)，間接反映了細(xì)胞遷徙能力的增強(qiáng)，這與Zhu等[3]的結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示BA原液組無論是在細(xì)胞增殖能力方面還是細(xì)胞覆蓋能力方面均優(yōu)于MTA原液組，說明BA比MTA具有更好的生物相容性。這可能與BA水合后含有羥基磷灰石有關(guān)，羥基磷灰石是牙齒和骨的主要成分，具有很強(qiáng)的生物相容性。另外兩種材料的成分不同，接觸培養(yǎng)基后釋放的物質(zhì)也不同。MTA主要成分為硅酸三鈣、硅酸二鈣、鋁酸三鈣和鋁鐵酸四鈣，此外還含有少量其他用于調(diào)節(jié)其物理和化學(xué)性質(zhì)的礦物質(zhì)，如三氧化二鉍使其具有X線阻射性。BA的主要成分是水合硅酸鈣、氫氧化鈣、羥基磷灰石、氧化鉭和無定型氧化硅。Park等[4]對(duì)MTA和BA固化前和固化后的化學(xué)成分進(jìn)行X線衍射分析，發(fā)現(xiàn)兩者化學(xué)成分基本相似，區(qū)別在于BA的X線阻射成分是氧化鉭，而MTA的阻射成分是氧化鉍。Camilleri等[5]將細(xì)胞平鋪在固化后的MTA表面進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)氧化鉍上沒有任何細(xì)胞生長。

BA作為一種新型的生物活性材料，其在無污染環(huán)境下生產(chǎn)，確保最后形成純凈、細(xì)膩的白色親水性粉末。Yan等[6]的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)了BA比MTA具有更好的生物相容性。Yuan等[7]通過評(píng)價(jià)MTA和BA對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞毒性和礦化相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)MTA和BA對(duì)成骨細(xì)胞均無細(xì)胞毒性，但與MTA比較，BA能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化相關(guān)基因I型膠原（COL I）、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)。 Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)BA較MTA更能增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的礦化能力和成牙本質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)基因的表達(dá)。然而也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)BA和MTA具有相似的生物相容性和成牙本質(zhì)細(xì)胞礦化能力[9]。Khalil等[10]將MTA和BA植入白化大鼠皮下，發(fā)現(xiàn)7d后兩者都能引起肝臟和腎臟組織明顯的炎癥反應(yīng)，而30d后植入BA的大鼠肝臟功能下降，植入MTA的大鼠肝臟功能有所上升。在本次體外模擬研究中，BA表現(xiàn)出比MTA更好的促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷徙覆蓋的能力。在今后的研究中我們將更著重于MTA和BA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為臨床應(yīng)用提供更加充分的佐證。

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Effects of MTA and BioAggregate on human dental pulp cells in an in vitro wound model

LI Ling,MEI Liqin,LI Jun.Department of Pediatric Dentistry,School and Hospital of Stomatology,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of mineral trioxide aggregate(MTA)and BioAggregate on the proliferation and wound covering of human dental pulp cells(HDPCs)in an in vitro wound model,and evaluate its biocompatibility. Methods Wounds were induced by making a 3 mm incision in cell monolayers across the length of tissue culture plates.The wound monolayers were treated with various dilutions of MTA and BioAggregate extracts for 24h to assess the cell proliferation and wound covering.MTA groups (undiluted MTA group,1/2 concentration MTA group,1/4 concentration MTA group)and BA groups(undiluted BA group,1/2 concentration BA group,1/4 concentration BA group)were the experimental groups,and DMEM bovine serum(10%FBS)served as the control group. Results Only BA undiluted extract increased cell proliferation ability(P＜0.05).Treatment with undiluted MTA extract,1/2 concentration MTA extract,undiluted BA extract and 1/2 concentration BA extract all enhanced cellular wound covering of HDPCs compared with those in control group(P＜0.05).Cells exposed to undiluted BA extract displayed higher cellular ability of proliferation and wound filling compared with those exposed to undiluted MTA extract (P＜0.05). Conclusion MTA and BioAggregate both have favorable biocompatibility,but BioAggregate is better than MTA.

Dental pulp MTA BioAggregate Wound healing modelBiocompatibility

2015-01-28）

（本文編輯：李媚）

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20120054）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科（李玲、梅麗琴），牙體牙髓科（李駿）

李駿，E-mail：lealyne@163.com