青海省不同緯度小檗屬3種植物不同部位小檗堿變化規(guī)律研究*

向前勝，王 寧，趙 越，鄒林有，孫 奎，王凱月

(1．青海大學(xué)，青海 西寧810016;2．青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧810016)

小檗科 (Berberidaceae)小檗屬 (Berberis)植物全世界約有500種，我國(guó)約200種，西南、西北等地區(qū)均有分布。青海省是小檗屬植物的重要分布區(qū)之一，有13種及1變種，西北小檗 (Berberis vernae)、鮮黃小檗 (B．diaphana)、直穗小檗(B．dasystachya)在青海省分布較廣，資源量十分豐富［1］。

小檗屬植物中所含的小檗堿是臨床上常用的抗菌消炎藥物之一，在中醫(yī)藥中有著很大的需求量［2～6］。目前小檗屬植物利用方式主要是采用挖根法，存在資源破壞嚴(yán)重，利用率低的問(wèn)題，加之對(duì)小檗植物化學(xué)資源狀況不清，在利用上存在很大的盲目性，加劇了小檗資源的破壞和浪費(fèi)。

由于環(huán)境因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)生著直接或間接的影響，因此，通過(guò)測(cè)定比較青海不同緯度3種小檗屬植物各部位的小檗堿含量，旨在尋找小檗堿含量隨緯度變化的規(guī)律，摸清小檗屬植物小檗堿化學(xué)資源狀況，為高效利用小檗屬植物資源提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品的采集和制備

(1)樣品采集 2014年9月，從青海省北緯39°12'57．15″～31°52'04．80″范圍內(nèi)分別采集3 種小檗屬植物樣品，經(jīng)青海省農(nóng)林科學(xué)院野生植物資源研究所鑒定為鮮黃小檗、直穗小檗和西北小檗。樣品采集點(diǎn)情況見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)地樣方為20 m×20 m，每個(gè)種在樣方內(nèi)不同位置隨機(jī)采5株。

表1 樣方基本情況Tab．1 Descriptions of plots

(2)樣品的制備 將采集到的新鮮小檗屬植物根部泥土處理干凈，自然干燥，按單株分別將根部、莖稈及枝梢分開(kāi)，將5株同種植物同部位分別稱取10 g混合，經(jīng)粉碎機(jī)處理，過(guò)65目篩 (四號(hào)篩)，保存待測(cè)。

1.2 儀器和試劑

Waters ELSD 2424高效液相色譜儀 (Waters公司)，Welchrom C18色譜柱 (月旭材料科技上海有限公司)，BS214S電子天平 (德國(guó) Sartorius公司)，微量移液器 (艾本德)，pH計(jì) (上海大普儀器有限公司)，KQ3200DE型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈為色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司生產(chǎn);甲醇為色譜純，美國(guó)fisher公司生產(chǎn);磷酸二氫鈉為分析純，成都科龍化學(xué)試劑廠生產(chǎn);鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 (HPLC測(cè)得含量≥98%):批號(hào)110713-201402，中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。

2 方法

2.1 鹽酸小檗堿含量的測(cè)定方法

本研究小檗堿含量的測(cè)定方法采用2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中“三顆針”的含量測(cè)定方法［7］，每樣品重復(fù)測(cè)定3次，取均值。

(1)色譜條件 色譜柱為Welchrom C18色譜柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0．02 mol/L磷酸二氫鈉 (24︰76);流速1．0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫30℃。

(2)對(duì)照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL 的 母液，用帶有0．45 μm過(guò)濾膜的微孔針頭取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣。精確吸取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣各20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度 (X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=4．99 e+004 X-1．08 e+005，R=0．999 277，結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在此條件下呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1，5次進(jìn)樣峰面積值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品Fig．1 The reference substance of Berberine Hydrochloride

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2 The standard curves of Berberine Hydrochloride

(3)供試品溶液的制備 取供試品粉末 (過(guò)四號(hào)篩)約0．1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(4)樣品測(cè)定 用帶有0．45 μm過(guò)濾膜的微孔針頭取供試樣品續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣，保留時(shí)間為16 min。

2.2 數(shù)據(jù)分析方法

采用 IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計(jì)分析軟件及Excel 2007數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)不同緯度、不同種、不同部位小檗屬植物中小檗堿含量之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

表2為不同小檗種、不同緯度、不同部位小檗堿含量的HPLC測(cè)定結(jié)果與多重比較結(jié)果。

表2 不同緯度3種小檗屬植物不同部位小檗堿含量的比較Tab．2 Comparison of different parts of Berberine in three kinds of Berberis with different latitude μg/mL

分析表2數(shù)據(jù)，對(duì)青海省不同緯度的3種小檗屬植物各部位小檗堿的含量進(jìn)行比較:不同緯度對(duì)3種小檗屬植物體內(nèi)各部位小檗堿的含量影響顯著(P＜0．05)。其中小檗堿主要集中于小檗屬植物的根部，在植株莖稈和枝梢部位也有分布。

西北小檗各部位小檗堿的含量在青海省采樣范圍內(nèi)隨緯度的升高呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，尤其根部表現(xiàn)最為明顯，最大值82．919 μg/mL是最小值17．057 μg/mL的4．86倍。

鮮黃小檗各部位小檗堿的含量在采樣范圍內(nèi)隨緯度的升高呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，根部小檗堿的含量從14．526 μg/mL 到 51．217 μg/mL，增加了2．52 倍。

直穗小檗各部位小檗堿的含量在采樣范圍內(nèi)隨緯度的升高而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其根部小檗堿的含量在東經(jīng) 35°14'17．51″處達(dá)到最高值71．777 μg/mL。

3 結(jié)語(yǔ)

同種藥用植物所含次生代謝產(chǎn)物含量的高低除與遺傳因素有密切關(guān)系外，所生存的環(huán)境和氣候條件等生態(tài)因子對(duì)其也有很大的影響［8～9］。隨著緯度的變化，氣候差異較大，植物的物候期不同，年生長(zhǎng)周期中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的起止時(shí)間也不同。即同一時(shí)期、同一無(wú)性系的生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化進(jìn)程不一致，植物次生代謝物合成積累進(jìn)程也不一致［10～12］。尤其在青海省境內(nèi)，自然地理環(huán)境特殊，海拔高，地形差異顯著，降水少，溫差大，日照時(shí)間長(zhǎng)，更加劇了緯度影響的差異。

本研究涉及青海省海東、海北、海南、黃南、玉樹(shù)、果洛等地區(qū)，隨著緯度的變化，不同種小檗屬植物各部位小檗堿含量的變化規(guī)律不同:西北小檗隨緯度升高而降低，鮮黃小檗隨緯度的升高而增加，直穗小檗隨緯度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

(1)從取樣區(qū)所跨越的緯度范圍來(lái)看，從南到北，隨著緯度升高，年均溫、降水量、日照時(shí)數(shù)逐漸減少，采樣地所在低緯度地區(qū)海拔較高，立地條件惡劣，日照時(shí)間較長(zhǎng)［13］，有助于小檗堿的積累，所以緯度較低地區(qū)的西北小檗體內(nèi)小檗堿的含量相對(duì)較高。在青海海北門源，青海玉樹(shù)1和青海玉樹(shù)2三處采樣點(diǎn)，由于所處海拔較高，引起相關(guān)生態(tài)因子的變化，其體內(nèi)小檗堿的含量出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。

(2)在青海省同一區(qū)域采樣范圍，鮮黃小檗的平均分布海拔要高于直穗小檗和西北小檗，其較適應(yīng)高寒環(huán)境。由于樹(shù)種的個(gè)體遺傳因素的差異，同一緯度高海拔地區(qū)日溫差較大，輻射較強(qiáng)，立地條件惡劣，所以鮮黃小檗體內(nèi)小檗堿的含量隨緯度變化的規(guī)律除與樹(shù)種的區(qū)別相關(guān)外，還與周圍的生態(tài)因素相關(guān)。在青海玉樹(shù)州的3個(gè)采樣點(diǎn)中，由于其分布海拔較高及局部環(huán)境的差異，導(dǎo)致該處鮮黃小檗體內(nèi)小檗堿的含量出現(xiàn)增加的情況。

(3)從青海省內(nèi)采樣范圍來(lái)看，直穗小檗分布地域有限，分布海拔介于其他兩個(gè)種之間，隨著緯度的升高，年均溫降低，溫度影響了植株體內(nèi)的酶活性，加上樹(shù)種、局部采樣地海拔等因素的影響，使次生代謝的強(qiáng)弱產(chǎn)生了差異，從而產(chǎn)生了隨緯度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象。

對(duì)于小檗堿隨著緯度變化的主要影響因子的分析，仍需進(jìn)一步的研究，以期更好地解釋小檗屬植物體內(nèi)小檗堿的含量隨著緯度變化的規(guī)律。根據(jù)本研究的結(jié)論，建議青海省在低緯度地區(qū)對(duì)西北小檗植物資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，對(duì)高緯度地區(qū)進(jìn)行鮮黃小檗植物資源的開(kāi)發(fā)利用，在北緯35°的位置對(duì)直穗小檗植物資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

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