利用半纖維素水解液中的木糖生物合成殼聚糖

林廣修 趙 華 劉 盼 車?yán)麄?/p>

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)

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·合成殼聚糖·

利用半纖維素水解液中的木糖生物合成殼聚糖

林廣修 趙 華 劉 盼 車?yán)麄?/p>

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)

研究了制漿廢液中半纖維素水解液中的木糖用于生物合成殼聚糖的脫毒及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明,最優(yōu)脫毒條件為：先加入Ca(OH)2調(diào)pH值至10,抽濾后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的H2SO4調(diào)pH值至7,再次抽濾后以1∶20的固液比加入活性炭,置于50℃搖床以120 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 h,抽濾后取上清液。雅致放射毛霉(ActinomucorelegansTCCC450005)生物合成殼聚糖的最佳培養(yǎng)條件為：以6%的玉米漿為氮源,以適當(dāng)稀釋(使木糖濃度為3%)的脫毒后制漿廢液為碳源,接入雅致放射毛霉,于30℃下培養(yǎng)60 h,菌絲體濃度可達(dá)15.20 g/L,殼聚糖產(chǎn)量為2.02 g/L。

殼聚糖;半纖維素;制漿廢液;脫毒;雅致放射毛霉

(*E-mail: bevallingx@163.com)

殼聚糖因其獨(dú)特的理化性質(zhì),可制備成不同結(jié)構(gòu)和特性的衍生物，應(yīng)用廣泛。在食品行業(yè)中,殼聚糖可用作果蔬涂膜保鮮劑、食品添加劑、釀酒與果汁澄清劑等,此外由于殼聚糖帶有大量氨基,是食物纖維素中唯一的陽離子聚合物,可吸附腸道中脂肪,因此具有降血脂、抗血栓、預(yù)防心腦血管疾病等功效,能與果膠等酸性多糖加工成高質(zhì)量、低熱量的保健食品；在醫(yī)藥領(lǐng)域中,殼聚糖可用作膠囊劑和緩釋劑,明顯改善藥物溶解性和吸收性,從而減少藥用次數(shù)、減輕毒副作用,此外,國內(nèi)已將殼聚糖無紡布、殼聚糖涂層紗布及殼聚糖流涎膜等材料用于臨床；在環(huán)保領(lǐng)域中,因殼聚糖對金屬離子有絡(luò)合吸附作用,可作為廢水處理中的金屬離子螯合劑和活性污泥絮凝劑,殼聚糖無毒無害,因此沉淀物可回收提純,用作原料或飼料,而絮凝劑經(jīng)過再生后又可重復(fù)利用[1-2]。目前殼聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)主要是從蝦、蟹殼中提取[3],但原料來源受季節(jié)和地域的影響,品質(zhì)難以控制,且提取過程耗堿量大,提取成本較高[4-6]。近年來,國內(nèi)外關(guān)于從真菌中提取殼聚糖的研究已逐漸興起,與傳統(tǒng)生產(chǎn)方式相比,從真菌中提取殼聚糖具有分離工藝簡便、原料來源穩(wěn)定、產(chǎn)品性能優(yōu)良、成本低等優(yōu)點(diǎn),經(jīng)濟(jì)效益和社會效益十分明顯[7],生產(chǎn)用真菌包括黑曲霉、米根霉、毛霉和犁頭霉等[8-10]。

造紙工業(yè)的廢水治理形勢依然嚴(yán)峻。2012年造紙業(yè)廢水排放量高達(dá)34.27億t,占全國工業(yè)廢水排放總量的16.9%,CODCr排放量為62.3萬t,占全國工業(yè)CODCr總排放量的20.5%[11]。原料蒸煮制漿過程中產(chǎn)生的制漿廢液占造紙廢水的90%[12]。

制漿主要有化學(xué)制漿、醇類有機(jī)溶劑制漿、有機(jī)酸溶劑制漿等方法[13]。制漿廢液的主要成分為木素、糖類及蒸煮所用的化學(xué)藥劑,具有一定的回收利用價值。目前制漿廢液的資源化利用研究要集中于木素的回收與利用[14]。制漿廢液中木糖含量較高,因此資源化利用方式可參考半纖維素水解液的回收利用工藝,近年來逐漸興起制漿廢液中木糖的回收利用研究,包括結(jié)晶制取木糖,或通過發(fā)酵生產(chǎn)酒精、木糖醇等產(chǎn)品[15-16],但還存在處理成本高、經(jīng)濟(jì)效益低等問題,如某些造紙廠將制漿廢液用大量活性炭脫毒后進(jìn)行結(jié)晶制取木糖,但結(jié)晶母液中仍有大量木糖殘留無法利用,且目前木糖市場趨于飽和,因此經(jīng)濟(jì)效益過低。而殼聚糖的市場需求量很大,且殼聚糖平均售價為木糖的數(shù)倍至十?dāng)?shù)倍,因此將制漿廢液用于合成殼聚糖具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。

本實(shí)驗(yàn)主要研究了制漿廢液脫毒條件和雅致放射毛霉菌體培養(yǎng)及殼聚糖生物合成培養(yǎng)條件對利用制漿廢液半纖維素水解液中的木糖生物合成生產(chǎn)殼聚糖的影響,旨在尋找一條制漿廢液資源化利用的新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

雅致放射毛霉(ActinomucorelegansTCCC450005),保藏于天津科技大學(xué)菌種保藏中心。

1.2 制漿廢液與木糖結(jié)晶母液

制漿廢液取自某造紙廠,pH值為2.0,木糖濃度約10%；木糖結(jié)晶母液取自同一造紙廠，該廠將制漿廢液經(jīng)活性炭脫毒處理后進(jìn)行結(jié)晶制取木糖,母液脫水后為固態(tài),木糖濃度約65%。

1.3 培養(yǎng)基的制備

1.3.1 斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)

200 g土豆切塊煮沸30 min后過濾取濾液,加入葡萄糖20 g,瓊脂20 g,定容至1000 mL,pH值不用調(diào)節(jié),115℃滅菌20 min。

1.3.2 殼聚糖合成培養(yǎng)基

將木糖結(jié)晶母液和脫毒處理后的制漿廢液適當(dāng)稀釋(使木糖濃度約為3%),向100 mL稀釋液中加入0.2 g MgSO4·7H2O,0.2 g KH2PO4及不同用量的玉米漿(玉米漿用量見2.3),pH值調(diào)至7,115℃滅菌20 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 木糖濃度的測定

本研究采用斐林法測定木糖結(jié)晶母液和制漿廢液中的木糖含量。

1.4.2 制漿廢液脫毒方法

1.4.2.1 Ca(OH)2中和脫毒

在制漿廢液中加入粉末狀Ca(OH)2調(diào)pH值至10,抽濾取濾液,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的H2SO4調(diào)pH值至7,抽濾取濾液。

1.4.2.2 Ca(OH)2二次脫毒

在中和脫毒得到的上清液中加入粉末狀Ca(OH)2調(diào)pH值至10,抽濾取濾液,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的H2SO4調(diào)pH值至7,抽濾取濾液。

1.4.2.3 活性炭脫毒

在二次脫毒得到的濾液中,以1∶20的固液比加入活性炭,置于50℃搖床以120 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 h,抽濾取濾液。

1.4.2.4 脫毒條件

采用不同脫毒條件,具體為：①不處理。②Ca(OH)2中和脫毒。③Ca(OH)2二次脫毒。④活性炭脫毒。⑤Ca(OH)2中和脫毒后再進(jìn)行活性炭脫毒。⑥Ca(OH)2二次脫毒后再進(jìn)行活性炭脫毒。

1.4.3 菌體培養(yǎng)

1.4.3.1 斜面培養(yǎng)

將雅致放射毛霉接種于PDA培養(yǎng)基,置于恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)3～7天,待斜面上長出大量孢子后取出。

1.4.3.2 殼聚糖生物合成培養(yǎng)

用10 mL無菌生理鹽水洗脫孢子,經(jīng)兩層無菌紗布過濾除去菌絲體,將濾液加入裝有少量玻璃珠的三角瓶中充分搖勻,即為孢子懸浮液。以血球計數(shù)板計數(shù),確定孢子懸浮液濃度,將其適當(dāng)稀釋,使最終孢子濃度為106個/mL。向50 mL殼聚糖合成培養(yǎng)基中接入3 mL孢子懸浮液,置于恒溫?fù)u床中在200 r/min的轉(zhuǎn)速下以不同溫度分別培養(yǎng)不同時間。

1.4.4 菌絲體收集

將培養(yǎng)液抽濾收集菌絲體,以蒸餾水洗滌菌絲體至濾液澄清,于65℃烘箱中烘干后稱量質(zhì)量。

1.4.5 殼聚糖提取

將烘干后的菌體充分研磨,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH溶液(菌體與溶液比為1∶20,W∶V)于100℃處理2 h后離心,得到的不溶物用蒸餾水洗滌至中性。再加入2%醋酸溶液(菌體與溶液比為1∶40,W∶V)于60℃處理3 h后離心,往上清液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的NaOH溶液至pH值為9,待出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀,靜置后離心。將沉淀物用蒸餾水洗滌至中性,離心收集沉淀物。于50℃烘箱烘干,即為殼聚糖粗品。將殼聚糖粗品用95%乙醇洗滌3次,再用丙酮洗滌2次,于50℃烘箱烘干,即為殼聚糖純品[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫毒條件對菌絲體濃度及殼聚糖產(chǎn)量的影響

以不同脫毒條件(見1.4.2.4)對制漿廢液進(jìn)行脫毒處理,測定處理后廢液中的木糖濃度。將脫毒處理后的廢液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使木糖濃度約為3%,向100 mL稀釋液中加入6 mL玉米漿(即用量為6%,玉米漿干物質(zhì)含量約為47%,以下同)、0.2 g MgSO4·7H2O、0.2 g KH2PO4,pH值調(diào)至7,接種量6%,裝液量為50 mL/250 mL,在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)60 h后測定菌體的菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量,結(jié)果見表1。

表1 脫毒條件對菌絲體濃度及殼聚糖產(chǎn)量的影響

從表1可以看出,菌體在未經(jīng)處理的制漿廢液中幾乎無法生長。經(jīng)Ca(OH)2中和脫毒后,由于菌體生長抑制物的去除,菌絲體濃度明顯上升。Ca(OH)2二次脫毒后菌絲體濃度反而有所下降,可能是因?yàn)槎蚊摱臼怪茲{廢液中的木糖濃度明顯下降,導(dǎo)致菌絲體濃度低于一次脫毒。僅使用活性炭進(jìn)行脫毒處理的效果比Ca(OH)2中和脫毒差。各脫毒條件中,使用Ca(OH)2中和脫毒后再進(jìn)行活性炭脫毒的效果最好。

2.2 氮源對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

脫毒處理后的廢液經(jīng)適當(dāng)稀釋,使木糖濃度約為3%,分別向100 mL稀釋液中加入2 g蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米漿,以及0.58 g NaNO3和0.73 g NH4NO3作為氮源(無機(jī)氮源的量以含氮量與有機(jī)氮源相同為準(zhǔn)),培養(yǎng)基其他成分及培養(yǎng)條件不變,培養(yǎng)60 h后測定菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量,結(jié)果見表2。

表2 氮源對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

由表2可知,雅致放射毛霉對有機(jī)氮源的利用效率要遠(yuǎn)高于無機(jī)氮源。4種有機(jī)氮源中酵母粉效果最好,玉米漿效果最差,但差距并不十分明顯,出于成本考慮,以玉米漿為氮源為宜。

2.3 玉米漿用量對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

以不同用量的玉米漿為氮源,培養(yǎng)基其他成分及培養(yǎng)條件不變,培養(yǎng)60 h后測定菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量,結(jié)果見圖1。

圖1 玉米漿用量對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

由圖1可知,隨著玉米漿用量的提高,菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量也隨之上升。當(dāng)玉米漿用量超過6%后,由于底物抑制,菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量有所下降。由此確定最佳玉米漿用量為6%,此時菌絲體濃度為15.21 g/L,殼聚糖產(chǎn)量為2.02 g/L。

2.4 碳源種類及木糖濃度對菌絲體濃度及殼聚糖產(chǎn)量的影響

分別以不同濃度的木糖結(jié)晶母液和脫毒處理后的制漿廢液為碳源(濃度以等效木糖濃度表示),培養(yǎng)基其他成分和培養(yǎng)條件不變,培養(yǎng)60 h后測定菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量,結(jié)果見圖2。

圖2 碳源種類及木糖濃度對菌絲體濃度及殼聚糖產(chǎn)量的影響

由圖2可知,當(dāng)木糖濃度低于3%時,菌絲體濃度及殼聚糖產(chǎn)量隨著木糖濃度增加而增大；當(dāng)木糖濃度超過3%后,由于底物抑制作用,菌絲體濃度及殼聚糖產(chǎn)量逐漸下降。因此最佳木糖濃度為3%,此時以脫毒后的制漿廢液為碳源的菌絲體濃度為15.21 g/L,殼聚糖產(chǎn)量為2.01 g/L。

此外,木糖結(jié)晶母液與脫毒后的制漿廢液均可作為碳源,當(dāng)木糖濃度為2%～5%時,以脫毒后制漿廢液為碳源的菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量高于以木糖結(jié)晶母液為碳源的菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量。這可能是因?yàn)樵旒垙S在進(jìn)行木糖結(jié)晶前使用了大量活性炭對制漿廢液進(jìn)行脫毒處理,使一些菌體生長因子和刺激物也一同被去除,從而導(dǎo)致了菌體生長量的下降。因此,較優(yōu)的碳源為脫毒后的制漿廢液。

2.5 溫度對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

選取不同的培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)基成分及其他培養(yǎng)條件不變,培養(yǎng)60 h后測定菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量,結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

由圖3可知,溫度對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響較大。在28～30℃的溫度范圍內(nèi),菌體生長最為旺盛,因此殼聚糖產(chǎn)量也最高。當(dāng)溫度繼續(xù)升高,超出菌體的最適生長溫度范圍時,菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量急劇下降。由此確定最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

2.6 培養(yǎng)時間對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

在相同培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)不同時間后,測定菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量,結(jié)果見圖4。

圖4 培養(yǎng)時間對菌絲體濃度和殼聚糖產(chǎn)量的影響

由圖4可知,在24～60 h時,菌體快速生長繁殖,殼聚糖也隨之大量累積。當(dāng)培養(yǎng)時間超過60 h后,菌體開始衰老自溶,細(xì)胞壁破碎,因此殼聚糖產(chǎn)量有所下降。由此確定最佳培養(yǎng)時間為60 h,此時菌絲體濃度可達(dá)15.20 g/L,殼聚糖產(chǎn)量為2.02 g/L。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究了利用制漿廢液中的半纖維素水解液中的木糖生物合成殼聚糖的脫毒和培養(yǎng)條件。

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用的各種脫毒條件中,使用Ca(OH)2中和脫毒后再進(jìn)行活性炭脫毒的效果最好。具體脫毒條件為：先加入Ca(OH)2調(diào)pH值至10,抽濾后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的H2SO4調(diào)pH值至7,再次抽濾后以1∶20的固液比加入活性炭,置于50℃搖床以120 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 h,抽濾后取上清液。

3.2 利用制漿廢液半纖維素水解液中木糖生物合成殼聚糖的最優(yōu)條件為：將脫毒后的制漿廢液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使木糖濃度約為3%,向稀釋液中加入玉米漿6 mL、0.2 g MgSO4·7H2O、0.2 g KH2PO4,初始pH值調(diào)至7,裝液量為50 mL/250 mL,在溫度30℃,轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)60 h,此時,殼聚糖菌絲體濃度可達(dá)15.20 g/L,殼聚糖產(chǎn)量可達(dá)2.02 g/L。

3.3 木糖結(jié)晶母液和脫毒處理后的制漿廢液均可作為雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)生物合成制備殼聚糖的碳源,但以脫毒處理后的制漿廢液為碳源較優(yōu)。

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(責(zé)任編輯：董鳳霞)

Biosynthesis of Chitosan Using Xylose from Hemicellulose Hydrolysate

LIN Guang-xiu*ZHAO Hua LIU Pan CHE Li-wei

(Key Lab of Industrial Microbial Fermentation of Ministry of Education, College of Biotechnology,TianjinUniversityofScience&Technology,Tianjin, 300457)

The detoxification technology and culture conditions of biosynthesis of chitosan using xylose from hemicelluloses hydrolysate such as pulping waste liquor were investigated. The detoxification technology was as follows: pH was adjusted to 10 with Ca(OH)2at first then adjusted back to 7 with 10% H2SO4after suction filtration, then activated carbon was added in a ratio of 1∶20(W∶V) after the second suction filtration, finally it was put on a rocking table at the tempreture of 50℃ and the rotating speed of 120 r/min for 2 hours, the supernatant after the final suction filtration was collected for cultivation. The culture conditions included that using 6% of corn milk as nitrogen source and properly diluted detoxicated pulping waste liquor (which contains 3% of xylose) as carbon source.Actinomucorelegans(TCCC450005) was cultured in this medium at 30℃ for 60 hours. The mycelia concentration was 15.20 g/L and the chitasan yield was 2.02 g/L.

chitosan; hemicellulose; pulping effluent; detoxification;Actinomucorelegans

林廣修先生，在讀碩士研究生；主要研究方向：纖維原料的綜合利用工藝。

2014- 12- 10(修改稿)

X793

A

0254- 508X(2015)05- 0032- 05